Модель in vitro для изучения дифференцировки и изменения мультиомики на эпителиальных клетках дыхательных путей мышей, стимулированных экстрактом сигаретного дыма

Резюме

В данной статье мы описываем in vitro модель выделения и дифференцировки эпителиальных клеток дыхательных путей мышей, уделяя особое внимание их акклиматизации к экстракту хронического сигаретного дыма (CSE). Модель может быть использована для всесторонней характеристики мультиомиксного воздействия КСО, что, возможно, дает представление о клеточных реакциях при хроническом воздействии дыма.

Аннотация

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) в значительной степени связана с воздействием табачного дыма. Изучение того, как эпителиальные клетки дыхательных путей функционально адаптируются к табачному дыму, имеет решающее значение для понимания патогенеза ХОБЛ. Настоящее исследование заключалось в создании модели in vitro с использованием первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей для имитации реального воздействия табачного дыма. В отличие от устоявшихся клеточных линий, первичные клетки сохраняют больше естественных свойств, включая модели роста, старения и дифференцировки. Эти клетки проявляют чувствительную воспалительную реакцию и эффективную дифференцировку, таким образом, точно представляя физиологические условия. В этой модели первичные эпителиальные клетки дыхательных путей мышей культивировались в течение 28 дней на границе раздела воздух-жидкость с оптимальной концентрацией экстракта сигаретного дыма (CSE), что приводило к трансформации монослоя недифференцированных клеток в псевдостратифицированный столбчатый эпителий, что свидетельствует об акклиматизации CSE. Затем был применен комплексный мультиомический анализ, чтобы выяснить механизмы, с помощью которых CSE влияет на дифференцировку базальных клеток дыхательных путей. Эти данные обеспечивают более глубокое понимание клеточных процессов, лежащих в основе прогрессирования ХОБЛ в ответ на воздействие табачного дыма.

Введение

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) представляет собой гетерогенное заболевание легких со сложными характеристиками, при этом пациенты с ХОБЛ постепенно становятся моложе¹. Курение, являющееся основным фактором риска развития ХОБЛ^2-го типа, оказывает глубокое воздействие на эпителиальные клетки дыхательных путей, которые служат первоначальным барьером против табачного дыма. Несмотря на эту известную связь, детально изученные механизмы, с помощью которых табачный дым вызывает изменения в эпителиальных клетках дыхательных путей, остаются недостаточно изученными. Глубокое понимание этих молекулярных изменений имеет важное значение для ранней диагностики маркеров и терапевтических мишеней для ХОБЛ.

Чтобы восполнить этот пробел, мы разработали новую модель in vitro с использованием эпителиальных клеток дыхательных путей мышей. Эти клетки были подвергнуты длительной стимуляции экстрактом сигаретного дыма (CSE), что позволило нам отслеживать динамические клеточные изменения и исследовать изменения в эпителиальных клетках дыхательных путей при длительной стимуляции табаком и лежащий в их основе механизм. В этой модели трансвелл использовали для обеспечения воздушно-жидкостного интерфейса эпителиальных клеток дыхательных путей, а экстракт сигаретного дыма стимулировали на ранней стадии дифференцировки эпителиальных клеток до окончания дифференцировки через 28 дней. В предыдущих исследованиях изучалась только дифференцировка и краткосрочная стимуляция эпителиальных клеток дыхательных путей (доминирование клеточной линии). Они были ограничены одним регуляторным путем 3,4,5,6. Тем не менее, представленный здесь протокол использует первичные эпителиальные клетки дыхательных путей мыши и оптимизирует процесс экстракции клеток для лучшей клеточной активности по сравнению с предыдущими методами культивирования эпителиальных клеток дыхательных путей. Эта модель фокусируется на изменениях в клеточной дифференцировке наряду с комплексным транскриптомным, протеомным, метаболомическим и эпигеномным анализами. Используя иммунофлуоресценцию и передовые методы мультиомики, мы стремились выяснить клеточные реакции эпителиальных клеток дыхательных путей на хроническое воздействие табачного дыма, тем самым способствуя более глубокому пониманию патогенеза ХОБЛ. Эта модель может быть использована для изучения изменений в характере дифференцировки эпителиальных клеток дыхательных путей и ее механизма, вызванных длительной стимуляцией различными загрязнителями.

протокол

Общий протокол требует 44 дня, включая 1 день на подготовку эпителиальных клеток дыхательных путей, выделенных из трахеи мышей, 15 дней на пролиферацию клеток и 28 дней на стимуляцию CSE на границе между воздухом и жидкостью. Все экспериментальные животные размещены в комнате барьерных животных SPF Центра экспериментов на животных Столичного медицинского университета и были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных и лабораторных животных Столичного медицинского университета (AEEI-2020-100) на соответствие требованиям руководящих принципов^ARRIVE7.

1. Выделение первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей из трахеи мышей

1. Подготовка
   1. Приготовьте полную среду расширения, смешав 1 мл добавки 50x и 0,05 мл гидрокортизона с базальной средой расширения 48,95 мл. Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 4 недель.
   2. Растворите 7,5 мг протеинады и 5 мг дезоксирибонуклеазы I в 5 мл F-12 Хамса для приготовления раствора протеиназы. Отфильтруйте его для стерилизации и храните при температуре 4 °C и используйте в течение 4 недель.
   3. Приготовьте растворы антибиотиков, добавив 0,05 мл 100-кратного пенициллина/стрептомицина и 0,01 мл 500-кратного гентамицина/амфотерицина к 5 мл полной расширяющей среды, PBS и раствора протеиназы (100 Ед/мл пенициллина, 100 Ед/мл стрептомицина, 10 мкг/мл гентамицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В). Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 4 недель.
   4. Стерилизуйте хирургические инструменты и подготовьте бокс биологической безопасности для изоляции клеток. Одновременно убедитесь, что стандартное оборудование для культивирования клеток готово к использованию.
   5. Приготовьте блюда, покрытые коллагеном из крысиного хвоста, добавив коллаген крысиного хвоста (100 мкг/мл в 0,02 N уксусной кислоты) в 100 мм чашки для культивирования и 24 мм трансвеллы (0,05 мл/^см2). Оставьте открытым на ночь под ультрафиолетовым светом для стерилизации.
2. Выделение первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей
   1. Используйте мышей C57BL/6 (в возрасте 6-8 недель, самец, с повышенным SPF) для выделения эпителиальных клеток трахеи. Усыпить с 1% передозировкой раствора пентобарбитала натрия (около 200 мг/кг). Используйте пять мышей для достаточного выхода клеток.
   2. Простерилизуйте мышь, погрузив ее в 75% раствор этанола, не погружая нос и рот в спирт, чтобы предотвратить попадание алкоголя в трахею.
   3. Препарируйте мышь.
      1. Используйте хирургические лезвия и щипцы, один комплект приспособлений для разрезания и вскрытия эпидермиса от нижней челюсти до брюшной полости мыши.
      2. Используйте другой набор хирургических инструментов, чтобы разорвать щитовидные железы с обеих сторон и удалить соединения между трахеей, окружающей мышечной тканью и пищеводом.
      3. После этого аккуратно разрежьте грудную клетку, с помощью щипцов углубитесь в грудную полость, удалите все легкое и найдите конец трахеи.
   4. Обработайте трахею.
      1. Вырежьте трахею от щитовидного хряща до трахео-бронхиальной ветви и поместите ее в предварительно холодную расширяющую среду, содержащую четыре антибиотика.
      2. Встряхните трубку, чтобы смыть как можно больше крови с поверхности трахеи, держите ее на льду, а затем начните операцию для следующей мыши.
   5. Перенесите все собранные трахеи в буфер PBS, содержащий четыре антибиотика (200 ЕД/мл пенициллина, 200 ЕД/мл стрептомицина, 20 г/мл гентамицина и 0,5 г/мл амфотерицина В) для предварительной обработки перед перевариванием.
   6. С помощью набора хирургических инструментов удалите сгустки и другие ткани с поверхностей трахеи, а затем разрежьте их на 1 см² размера.
   7. Инкубировать ткань трахеи в растворе протеиназы при 37 °С в течение 40 мин.
   8. Через 40 минут покачайте трубку несколько раз и используйте клеточный фильтр 40 мкм для удаления оставшихся тканей. Измельченные трахеи промойте на ситечке с 5 мл расширяющей среды, центрифугируйте клеточную суспензию при 400 х г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
   9. Ресуспендируйте полученные клетки в 8 мл расширяющей среды.
   10. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
   11. Планшет P0 суспензируют клетки на 100 мм чашках (1 x 10⁴ живых клеток/^см2), предварительно покрытых коллагеном из крысиного хвоста, и культивируют клетки в инкубаторе при 37 °C, 5% CO₂.

2. Культивирование экспансии и пассаж первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей

1. Заменяйте среду для клеточной культуры P0 каждые 3 дня до тех пор, пока клетки не достигнут 70%-80% конфлюенции, обычно в течение 6 дней. На этом этапе эпителиальные клетки трахеи мышей могут образовывать неповрежденный монослой с видом булыжника (рисунок 1A-D).
2. Предварительно нагрейте достаточные объемы PBS, полную расширяющую среду и комплект для диссоциации клеток животного происхождения (ACF) до 37 °C.
3. Аккуратно промойте клетки 3 мл PBS.
4. Проводят ферментативную диссоциацию.
   1. Добавьте в чашку 3 мл раствора ферментативной диссоциации ACF и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут. После пипетирования аккуратно вытесните клетки и перенесите клеточную суспензию в 3 мл раствора ингибирования фермента ACF.
   2. Повторите добавление 3 мл раствора ферментативной диссоциации ACF и снова инкубируйте в течение 5 мин для обеспечения максимальной отслойки клеток.
5. Вращайте клеточную суспензию при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
6. Ресуспендируйте клетки в 1 мл расширяющей среды.
7. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего и гемоцитометра.
8. Планшет P1 суспензируют клетки на нескольких 100 мм чашках (5 x 10^{4 живых клеток} /^см2), предварительно покрытых коллагеном из крысиного хвоста, и культивируют клетки в инкубаторе при 37 °C, 5% CO₂.

3. Дифференцировка и стимуляция КСЭ первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей на границе раздела воздух-жидкость

1. Подтвердите тип ячейки.
   1. Верифицировать эпителиальное происхождение выделенных клеток с помощью иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) с антителами к цитокератинам. Семенные клетки на предметных стеклах покрыты коллагеном крысиного хвоста и используют параформальдегид для их фиксации в течение как минимум 12 часов после того, как клетки достигнут 80% конфлюенции.
   2. Промыть предметные стекла 3 раза раствором PBS в течение 5 мин и инкубировать их с 3% BSA и 0,1% triton X-100 в растворе PBS при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
   3. Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при 4 °C с коммерческими антителами против панцитокератина в разведении 1:500.
   4. На следующий день промыть предметные стекла 3 раза раствором PBS в течение 5 мин и инкубировать их с буфером вторичных антител в разведении 1:1000 при РТ в течение 2 ч в темноте.
   5. После инкубации промыть предметные стекла 3 раза PBS (5 мин на промывку), и добавить к ним DAPI в разведении 1:1000. После инкубации в RT в течение 15 мин промойте предметные стекла PBS один раз в течение 5 мин.
   6. Рассмотрите предметные стекла под флуоресцентным микроскопом и сравните паттерны экспрессии с положительным контролем (клеточная линия A549) и отрицательным контролем (клеточная линия Raw264.7) (рис. 2).
2. Засейте клетки для дифференцировки.
   1. Отделить и центрифугировать Р2-клетки, как описано выше, и повторно суспендировать клеточную гранулу в соответствующем объеме расширяющей среды для облегчения осаждения 1 x 10⁴ живых клеток/^см2.
   2. Пипеткой 1 мл клеточной суспензии нанесите на апикальную камеру мембранной вставки из поликарбоната transwell. В базальный отсек трансвелла добавьте 1,5 мл пролиферационной среды.
3. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C и полностью меняйте всю среду в базальной и апикальной камерах каждые 3 дня с использованием расширяющей среды до тех пор, пока не будет достигнуто слияние. Обычно это занимает 3-6 дней.
4. Приготовьте 50 мл среды для полной дифференцировки, добавив 5 мл добавки ALI 10x, 500 мл поддерживающей добавки ALI, 100 мл раствора гепарина и 250 мл стокового раствора гидрокортизона к 44,15 мл базальной среды ALI.
5. Подготовьте CSE.
   1. Проведите одну сигарету через 12,5 мл дифференцировочной среды, а затем отфильтруйте ее через фильтр пор 0,22 мкм для приготовления CSE. Чтобы обеспечить стандартизацию между экспериментами и партиями CSE, измерьте поглощение на длине волны 320 нм на спектрофотометре и определите оптическую плотность (OD) 1 как 100%⁸.
6. Используйте среду для дифференцировки, содержащую соответствующую концентрацию CSE, для стимуляции первичных эпителиальных клеток дыхательных путей мышей с целью выявления эффектов на дифференцировку клеток.
7. Дают клеткам дифференцироваться в течение 28 дней, в течение которых изменяют среду базальной камеры, а апикальную сторону промывают два раза в неделю путем удаления среды апикальной камеры и замены среды базальной камеры средой для дифференцировки, содержащей соответствующую концентрацию CSE.
8. Проанализируйте клетки после контакта.
   1. После контакта с дифференцировочной средой, содержащей CSE, в любой момент времени (т.е. через 0-28 дней) проводят забор клеток и надосадочной жидкости для выявления морфологических изменений (т.е. иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) или окрашивания гематоксилин-эозином (ПЭ) или для биоинформатических аналитических процедур (т.е. транскриптомики, протеомики, метаболомики и т.д.).

Результаты

Дифференциация
Эпителиальные клетки дыхательных путей мышей успешно дифференцировались после культивирования на границе воздух-жидкость со средой для дифференцировки в течение 28 дней. Наличие реснитчатых и бокаловидных клеток было продемонстрировано иммунофлуоресцентн...

Обсуждение

ХОБЛ является распространенным хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей. Воздействие табачного дыма приводит к хроническому воспалению дыхательных путей, ремоделированию дыхательных путей и структурному разрушению легких, что является результатом взаимодействия...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050