タバコ煙抽出物で刺激したマウス気道上皮細胞上のマルチオミクスの分化と変化を研究するためのin vitroモデル

要約

ここでは、マウス気道上皮細胞を単離および分化するための in vitro モデルについて、慢性タバコ煙抽出物(CSE)への順応に焦点を当てて説明します。このモデルは、CSEのマルチオミクスの影響を包括的に特徴付けるために利用できる可能性があり、慢性的な煙曝露下での細胞応答に関する洞察が得られる可能性があります。

要約

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、主にタバコの煙への曝露に起因しています。気道上皮細胞がタバコの煙にどのように機能的に適応するかを調べることは、COPDの病因を理解するために重要です。本研究は、タバコの煙の実際の影響を模倣するために、初代マウス気道上皮細胞を使用して in vitro モデルを設定することでした。確立された細胞株とは異なり、初代細胞は、成長パターン、老化、分化など、 in vivo様の特性をより多く保持します。これらの細胞は、敏感な炎症反応と効率的な分化を示し、生理学的条件を密接に表しています。このモデルでは、初代マウス気道上皮細胞を、最適な濃度のタバコ煙抽出物(CSE)を含む気液界面下で28日間培養したところ、未分化細胞の単層が偽層状の円柱状上皮に変換され、CSEの順化が示されました。次に、包括的なマルチオミクス解析を適用して、CSEが基底気道細胞の分化に影響を与えるメカニズムを解明しました。これらの知見は、タバコの煙への曝露に反応してCOPDの進行を支える細胞プロセスのより深い理解を提供します。

概要

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、複雑な特徴を持つ不均一な肺疾患ですが、COPDの患者は徐々に若くなる傾向があります¹。COPD² の主要な危険因子である喫煙は、タバコの煙に対する最初のバリアとして機能する気道上皮細胞に大きな影響を与えます。この既知の関連性にもかかわらず、タバコの煙が気道上皮細胞の変化を誘発する詳細なメカニズムは、まだ十分に調査されていません。これらの分子変化を完全に理解することは、COPDの早期診断マーカーと治療標的を特定するために不可欠です。

このギャップに対処するために、マウス気道上皮細胞を用いた新しいin vitroモデルを開発しました。これらの細胞にタバコ煙抽出物(CSE)を長期間刺激することで、細胞のダイナミックな変化をモニターし、長期タバコ刺激下での気道上皮細胞の変化とそのメカニズムを探ることができました。このモデルでは、トランズウェルを使用して気道上皮細胞の気液界面を提供し、上皮細胞分化の初期段階でタバコの煙抽出物を刺激し、28日で分化が終了するまで刺激しました。これまでの研究では、気道上皮細胞の分化と短期的な刺激(細胞株優位)のみが調査されていました。それらは単一の調節経路3,4,5,6に限定されていました。

プロトコル

全体のプロトコルには44日が必要で、これにはマウスの気管から単離された気道上皮細胞の調製に1日、細胞増殖に15日、気液界面でのCSE刺激に28日が含まれます。すべての実験動物は、首都医科大学動物実験センターのSPFバリア動物室に収容されており、首都医科大学の動物実験および実験動物倫理委員会(AEEI-2020-100)によってARRIVEガイドライン⁷の要件を満たすための審査および承認を受けています。

1. マウス気管からの初代マウス気道上皮細胞の単離

1. 準備
   1. 1 mLの50xサプリメントと0.05 mLのヒドロコルチゾンストックを48.95 mLの拡張基礎培地と組み合わせて、完全な拡張培地を調製します。4°Cで保存し、4週間以内にご使用ください。
   2. 7.5 mgのプロテイナーゼと5 mgのデオキシリボヌクレアーゼIを5 mLのハムF-12に溶解して、プロテイナーゼ溶液を調製します。ろ過して滅菌し、4°Cで保存し、4週間以内に使用してください。
   3. 0.05 mLの100xペニシリン/ストレプトマイシンと0.01 mLの500xゲンタマイシン/アムホテリシンを5 mLの完全増殖培地、PBS、およびプロテイナーゼ溶液(100 U/mLペニシリン、100 U/mLストレプトマイシン、10 μg/mLゲンタマイシン、0.25 μg/....

ディスカッション

COPDは、一般的な慢性気道炎症性疾患です。タバコの煙への曝露は、慢性的な気道の炎症、気道のリモデリング、および肺の構造破壊を引き起こしますが、これはさまざまな構造細胞と免疫細胞の相互作用の結果です¹⁰。肺の自然免疫系の最前線として、気道上皮細胞は病気の発症において非常に重要な役割を果たします¹¹。この観点から、有害物質の刺激?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050