A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מודל In Vitro לחקר התמיינות ושינויים של מולטי-אומיקה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של מורין המגורות באמצעות תמצית עשן סיגריות
In This Article
Summary
במאמר זה אנו מתארים מודל במבחנה לבידוד והתמיינות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, תוך התמקדות בהתאקלמותם לתמצית עשן סיגריות כרונית (CSE). ניתן להשתמש במודל כדי לאפיין באופן מקיף את ההשפעה הרב-אומית של CSE, מה שעשוי לספק תובנות לגבי התגובות התאיות תחת חשיפה כרונית לעשן.
Abstract
מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) מיוחסת במידה רבה לחשיפה לעשן טבק. חקירת האופן שבו תאי אפיתל בדרכי הנשימה מסתגלים באופן פונקציונלי לעשן טבק חיונית להבנת הפתוגנזה של COPD. המחקר הנוכחי נועד להקים מודל במבחנה המשתמש בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה כדי לחקות את ההשפעה בחיים האמיתיים של עשן טבק. שלא כמו קווי תאים מבוססים, תאים ראשוניים שומרים יותר על תכונות דמויות vivo, כולל דפוסי גדילה, הזדקנות והתמיינות. תאים אלה מפגינים תגובה דלקתית רגישה והתמיינות יעילה, ובכך מייצגים באופן הדוק מצבים פיזיולוגיים. במודל זה, תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של מורין גודלו בתרבית במשך 28 יום תחת ממשק אוויר-נוזל עם ריכוז אופטימלי של תמצית עשן סיגריות (CSE), מה שהוביל להפיכת שכבה אחת של תאים לא ממוינים לאפיתל עמודתי פסאודוסטרטי, המעיד על אקלום CSE. לאחר מכן יושמו ניתוחים מולטי-אומיים מקיפים כדי להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם CSE משפיע על ההתמיינות של תאי דרכי הנשימה הבסיסיים. תובנות אלה מספקות הבנה עמוקה יותר של התהליכים התאיים העומדים בבסיס התקדמות COPD בתגובה לחשיפה לעשן טבק.
Introduction
מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) היא מחלת ריאות הטרוגנית עם מאפיינים מורכבים, בעוד חולים עם COPD נוטים בהדרגה להיות צעיריםיותר 1. לעישון, גורם סיכון עיקרי ל- COPD2, יש השפעה עמוקה על תאי אפיתל בדרכי הנשימה, המשמשים כמחסום הראשוני מפני עשן טבק. למרות הקשר הידוע הזה, המנגנונים המפורטים שבאמצעותם עשן טבק גורם לשינויים בתאי אפיתל בדרכי הנשימה עדיין לא נחקרו כראוי. הבנה מעמיקה של שינויים מולקולריים אלה חיונית לזיהוי סמנים אבחוניים מוקדמים ומטרות טיפוליות ל- COPD.
כדי להתמודד עם הפער הזה, פיתחנו מודל חדשני במבחנה באמצעות תאי אפיתל של דרכי הנשימה. תאים אלה היו נתונים לגירוי ארוך טווח באמצעות....
Protocol
הפרוטוקול הכולל דורש 44 ימים, כולל יום אחד להכנת תאי אפיתל בדרכי הנשימה שבודדו מקנה הנשימה של מורין, 15 יום להתרבות תאים, ו-28 ימים לגירוי CSE בממשק אוויר-נוזל. כל חיות הניסוי שוכנות בחדר בעלי החיים SPF Barrier של מרכז הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל ונבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים וחיות מעבדה של האוניברסיטה הרפואית קפיטל (AEEI-2020-100) כדי לעמוד בדרישות הנחיות ARRIVE7.
1. בידוד תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של מורין מקנה הנשימה של מורין
- הכנה
- הכן מדיום הרחבה מלא על ידי שילוב של 1 מ"ל של תוסף 50x ו- 0.05 מ"ל של מלאי הידרוקורטיזון עם מדיום בסי....
תוצאות
בידול
תאי אפיתל של דרכי הנשימה התמינו בהצלחה לאחר תרבית בממשק אוויר-נוזל עם מדיום התמיינות במשך 28 ימים. נוכחותם של תאי ריסון וגביע הודגמה על ידי בדיקת אימונופלואורסנציה של סמן ריסונים אצטילאט α-טובולין (ירוק; איור 3A) וסמן תא הגביע Mucin5AC, בהתאמה6 (אדום; א?.......
Discussion
COPD היא מחלה דלקתית כרונית נפוצה בדרכי הנשימה. חשיפה לעשן טבק מובילה לדלקת כרונית בדרכי הנשימה, לעיצוב מחדש של דרכי הנשימה ולהרס מבני של הריאות, שהוא תוצאה של אינטראקציה בין תאים מבניים שונים לבין תאי מערכת החיסון10. כקו הקדמי של מערכת החיסון המולדת בריאה, תאי אפיתל בדרכי הנשימה.......
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82090013).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 15140122 | |
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile | BIOFIL | TCS016012 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 500x Gentamicin/Amphotericin Solution | Gibco | R01510 | |
| acetylated α-Tubulin | CST | #5335 | |
| Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb | cellsignal | #5335 | |
| Animal Component Free Cell Dissociation Kit | Stemcell | 05426 | |
| Anti-pan Cytokeratin antibody | abcam | ab7753 | |
| Cigarette | Marlboro | ||
| Claudin3 | immunoway | YT0949 | |
| Deoxyribonuclase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Deoxyribonuclase I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | |
| Ham’s F-12 | Sigma-Aldrich | N6658 | |
| Heparin Solution | Stemcell | 07980 | |
| Hydrocortisone Stock Solution | Stemcell | 07925 | |
| Mucin 5AC | abcam | ab212636 | |
| Occludin | proteintech | 27260-1-AP | |
| PBS | Cytosci | CBS004S-BR500 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140122 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | Stemcell | 05002 | |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | Stemcell | 05003 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | Stemcell | 05006 | |
| PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement | Stemcell | 05042 | |
| PneumaCult-Ex Plus Basal Medium | Stemcell | 05041 | |
| Pronase E | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Rat tail collagen | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue | Stemcell | 07050 |
References
- Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
- Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved