מודל In Vitro לחקר התמיינות ושינויים של מולטי-אומיקה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של מורין המגורות באמצעות תמצית עשן סיגריות

Summary

במאמר זה אנו מתארים מודל במבחנה לבידוד והתמיינות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, תוך התמקדות בהתאקלמותם לתמצית עשן סיגריות כרונית (CSE). ניתן להשתמש במודל כדי לאפיין באופן מקיף את ההשפעה הרב-אומית של CSE, מה שעשוי לספק תובנות לגבי התגובות התאיות תחת חשיפה כרונית לעשן.

Abstract

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) מיוחסת במידה רבה לחשיפה לעשן טבק. חקירת האופן שבו תאי אפיתל בדרכי הנשימה מסתגלים באופן פונקציונלי לעשן טבק חיונית להבנת הפתוגנזה של COPD. המחקר הנוכחי נועד להקים מודל במבחנה המשתמש בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה כדי לחקות את ההשפעה בחיים האמיתיים של עשן טבק. שלא כמו קווי תאים מבוססים, תאים ראשוניים שומרים יותר על תכונות דמויות vivo, כולל דפוסי גדילה, הזדקנות והתמיינות. תאים אלה מפגינים תגובה דלקתית רגישה והתמיינות יעילה, ובכך מייצגים באופן הדוק מצבים פיזיולוגיים. במודל זה, תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של מורין גודלו בתרבית במשך 28 יום תחת ממשק אוויר-נוזל עם ריכוז אופטימלי של תמצית עשן סיגריות (CSE), מה שהוביל להפיכת שכבה אחת של תאים לא ממוינים לאפיתל עמודתי פסאודוסטרטי, המעיד על אקלום CSE. לאחר מכן יושמו ניתוחים מולטי-אומיים מקיפים כדי להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם CSE משפיע על ההתמיינות של תאי דרכי הנשימה הבסיסיים. תובנות אלה מספקות הבנה עמוקה יותר של התהליכים התאיים העומדים בבסיס התקדמות COPD בתגובה לחשיפה לעשן טבק.

Introduction

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) היא מחלת ריאות הטרוגנית עם מאפיינים מורכבים, בעוד חולים עם COPD נוטים בהדרגה להיות צעירים^{יותר 1}. לעישון, גורם סיכון עיקרי ל- COPD², יש השפעה עמוקה על תאי אפיתל בדרכי הנשימה, המשמשים כמחסום הראשוני מפני עשן טבק. למרות הקשר הידוע הזה, המנגנונים המפורטים שבאמצעותם עשן טבק גורם לשינויים בתאי אפיתל בדרכי הנשימה עדיין לא נחקרו כראוי. הבנה מעמיקה של שינויים מולקולריים אלה חיונית לזיהוי סמנים אבחוניים מוקדמים ומטרות טיפוליות ל- COPD.

כדי להתמודד עם הפער הזה, פיתחנו מודל חדשני במבחנה באמצעות תאי אפיתל של דרכי הנשימה. תאים אלה היו נתונים לגירוי ארוך טווח באמצעות תמצית עשן סיגריות (CSE), מה שאיפשר לנו לעקוב אחר שינויים תאיים דינמיים ולחקור את השינויים בתאי אפיתל בדרכי הנשימה תחת גירוי טבק ארוך טווח והמנגנון הבסיסי. במודל זה, Transwell שימש כדי לספק את ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה, ותמצית עשן סיגריות היה מגורה בשלב המוקדם של התמיינות תאי אפיתל עד סוף התמיינות לאחר 28 ימים. מחקרים קודמים בדקו רק התמיינות וגירוי לטווח קצר של תאי אפיתל בדרכי הנשימה (דומיננטיות קו התא). הם הוגבלו למסלול רגולטורי יחיד 3,4,5,6. עם זאת, הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של עכברים ומייעל את תהליך מיצוי התאים לפעילות תאים טובה יותר מאשר שיטות קודמות של תרבית תאי אפיתל בדרכי הנשימה. מודל זה מתמקד בשינויים בהתמיינות התא לצד אנליזות שעתוק מקיפות, פרוטאומיות, מטבוליות ואפיגנומיות. תוך שימוש באימונופלואורסנציה ובטכניקות מולטי-אומיקה מתקדמות, מטרתנו הייתה להבהיר את התגובות התאיות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה לחשיפה כרונית לעשן טבק, ובכך לתרום להבנה עמוקה יותר של פתוגנזה של COPD. מודל זה יכול לשמש לחקר השינויים בדפוס התמיינות תאי אפיתל בדרכי הנשימה והמנגנון שלו הנגרם על ידי גירוי ארוך טווח של מזהמים שונים.

Protocol

הפרוטוקול הכולל דורש 44 ימים, כולל יום אחד להכנת תאי אפיתל בדרכי הנשימה שבודדו מקנה הנשימה של מורין, 15 יום להתרבות תאים, ו-28 ימים לגירוי CSE בממשק אוויר-נוזל. כל חיות הניסוי שוכנות בחדר בעלי החיים SPF Barrier של מרכז הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל ונבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים וחיות מעבדה של האוניברסיטה הרפואית קפיטל (AEEI-2020-100) כדי לעמוד בדרישות הנחיות ARRIVE⁷.

1. בידוד תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של מורין מקנה הנשימה של מורין

1. הכנה
   1. הכן מדיום הרחבה מלא על ידי שילוב של 1 מ"ל של תוסף 50x ו- 0.05 מ"ל של מלאי הידרוקורטיזון עם מדיום בסיס הרחבה של 48.95 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 4 שבועות.
   2. להמיס 7.5 מ"ג של פרוטאינאז ו 5 מ"ג של deoxyribonuclease I ב 5 מ"ל של F-12 של Ham כדי להכין פתרון proteinase. יש לסנן אותו כדי לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 4 שבועות.
   3. הכינו תמיסות אנטיביוטיות על ידי הוספת 0.05 מ"ל של 100x פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.01 מ"ל של 500x גנטמיצין/אמפוטריצין ל-5 מ"ל של תמיסת התפשטות מלאה, PBS ופרוטאינאז (100 U/mL פניצילין, 100 U/mL סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 4 שבועות.
   4. לעקר מכשירי ניתוח ולהכין את ארון הבטיחות הביולוגי לבידוד תאים. במקביל, ודא שהציוד הסטנדרטי לתרביות תאים מוכן לשימוש.
   5. הכינו כלים מצופים קולגן בזנב חולדה על ידי הוספת קולגן זנב חולדה (100 מיקרוגרם/מ"ל ב-0.02 N חומצה אצטית) לצלחות תרבית בקוטר 100 מ"מ ולטרנסוולים בקוטר 24 מ"מ (0.05 מ"ל/ס"מ²). יש להשאיר פתוח למשך הלילה תחת אור UV לצורך עיקור.
2. בידוד תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה
   1. יש להשתמש בעכברי C57BL/6 (בני 6-8 שבועות, זכרים, בעלי SPF) לבידוד תאי אפיתל קנה הנשימה. המתת חסד עם מנת יתר של תמיסת נתרן פנטוברביטלית 1% (כ-200 מ"ג/ק"ג). השתמש בחמישה עכברים לתפוקת תאים מספקת.
   2. לעקר את העכבר על ידי טבילה בתמיסת אתנול 75%, לא לטבול את האף והפה באלכוהול כדי למנוע אלכוהול לזרום לתוך קנה הנשימה.
   3. נתח את העכבר.
      1. השתמש להבים כירורגיים ומלקחיים, קבוצה אחת של מכשירים לחיתוך ופתיחת האפידרמיס מהלסת התחתונה לחלל הבטן של העכבר.
      2. השתמש קבוצה נוספת של כלי ניתוח כדי לקרוע את בלוטות התריס משני הצדדים ולהסיר את הקשרים בין קנה הנשימה, רקמת השריר שמסביב, ואת הוושט.
      3. לאחר מכן, בזהירות לחתוך לתוך החזה, להשתמש מלקחיים להתעמק לתוך חלל החזה, להוציא את הריאה כולה, ולמצוא את קצה קנה הנשימה.
   4. לעבד את קנה הנשימה.
      1. חותכים את קנה הנשימה מסחוס בלוטת התריס לענף קנה הנשימה-סימפונות ומכניסים אותו למדיום הרחבה טרום קר המכיל ארבע אנטיביוטיקה.
      2. נער את הצינור כדי לשטוף כמה שיותר דם מפני השטח של קנה הנשימה, לשמור אותו על קרח, ולאחר מכן להתחיל את הניתוח עבור העכבר הבא.
   5. העבירו את כל קנה הנשימה שנאספו למאגר PBS טרום קר המכיל ארבע תרופות אנטיביוטיות (200 U/mL פניצילין, 200 U/mL סטרפטומיצין, 20 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B) לטיפול מקדים לפני העיכול.
   6. השתמש קבוצה של כלי ניתוח כדי להסיר קרישי דם ורקמות אחרות מן פני השטח של קנה הנשימה, ולאחר מכן לחתוך אותם לתוך 1 ס"מ² גודל.
   7. לדגור על רקמת קנה הנשימה בתמיסת פרוטאינאז בטמפרטורה של 37°C למשך 40 דקות.
   8. לאחר 40 דקות, נענעו את הצינור מספר פעמים והשתמשו במסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר את הרקמות הנותרות. שוטפים את קנה הנשימה הקצוץ על מסננת עם 5 מ"ל של תווך הרחבה, צנטריפוגות את תרחיף התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ומשליכים את supernatant.
   9. להשעות מחדש את התאים המתקבלים ב 8 מ"ל של מדיום הרחבה.
   10. ספור את התאים קיימא באמצעות כחול טריפאן המוציטומטר.
   11. תרחיף תאי צלחת P0 על צלחות 100 מ"מ (1 x 10⁴ תאים חיים / ס"מ²) מצופה מראש בקולגן זנב חולדה, ותרבית את התאים באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂.

2. תרבית הרחבה ומעבר של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה

1. החלף את המדיום עבור תרבית תאי P0 כל 3 ימים עד שהתאים מגיעים למפגש של 70%-80%, בדרך כלל תוך 6 ימים. בנקודה זו, תאי אפיתל קנה הנשימה יכולים ליצור שכבה חד-שכבתית שלמה עם מראה מרוצף אבן (איור 1A-D).
2. חימום מראש של נפחים מספיקים של PBS, מדיום הרחבה מלא וערכת דיסוציאציה של תאים ללא רכיבים מן החי (ACF) ל-37°C.
3. לשטוף בעדינות את התאים עם 3 מ"ל של PBS.
4. בצע דיסוציאציה אנזימטית.
   1. הוסיפו 3 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה אנזימטית ACF לצלחת ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. לאחר הפיפט, יש לעקור את התאים בעדינות ולהעביר את תרחיף התא ל-3 מ"ל של תמיסת עיכוב אנזים ACF.
   2. חזור על תוספת של 3 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה אנזימטית ACF ודגור שוב במשך 5 דקות כדי להבטיח ניתוק תאים מרבי.
5. סובב את מתלה התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
6. להשעות את התאים ב 1 מ"ל של מדיום הרחבה.
7. ספור את התאים קיימא באמצעות כחול טריפאן המוציטומטר.
8. לוח P1 תרחיף תאים על מספר צלחות 100 מ"מ (5 x 10⁴ תאים חיים / ס"מ²) מצופה מראש בקולגן זנב חולדה, ותרבית את התאים באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO₂.

3. התמיינות וגירוי CSE של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה בממשק אוויר-נוזל

1. אשר את סוג התא.
   1. אמת את מקור האפיתל של תאים מבודדים באמצעות בדיקת immunofluorescence (IFA) עם נוגדנים נגד cytokeratins. תאי זרעים על שקופיות זכוכית המצופים בקולגן זנב חולדה ומשתמשים בפרפורמלדהיד כדי לקבע אותם לפחות 12 שעות לאחר שהתאים מגיעים למפגש של 80%.
   2. שטפו שקופיות 3 פעמים עם תמיסת PBS למשך 5 דקות ודגרו עליהן עם 3% BSA ו-0.1% טריטון X-100 בתמיסת PBS בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת.
   3. יש לדגור על מגלשות לילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדן מסחרי נגד פאן ציטוקרטין בדילול של 1:500.
   4. למחרת, שטפו מחליקים 3 פעמים עם תמיסת PBS למשך 5 דקות ודגרו עליהם עם חיץ נוגדנים משני בדילול של 1:1000 ב- RT למשך שעתיים בחושך.
   5. לאחר הדגירה, יש לשטוף את המגלשות 3 פעמים עם PBS (5 דקות לכל כביסה), ולהוסיף להן DAPI בדילול של 1:1000. לאחר הדגירה ב-RT במשך 15 דקות, שטפו את המגלשות פעם אחת עם PBS למשך 5 דקות.
   6. צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי והשוו דפוסי ביטוי לבקרה חיובית (קו תאים A549) ולבקרה שלילית (קו תאים Raw264.7) (איור 2).
2. זרעו את התאים להתמיינות.
   1. נתק וצנטריפוגה תאי P2 כפי שתואר קודם לכן, והשהה מחדש את כדורית התא בנפח מתאים של אמצעי התפשטות כדי להקל על ציפוי של 1 x 10⁴ תאים חיים / ס"מ².
   2. פיפטה 1 מ"ל של תרחיף התא על התא האפי של קרום פוליקרבונט transwell להחדיר. לתא הבסיסי של הטרנסוול, הוסף 1.5 מ"ל של אמצעי התפשטות.
3. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C ולשנות באופן מלא את כל התווך בתאי הבסיס והאפיק כל 3 ימים באמצעות מדיום התפשטות עד למפגש ביניהם. פעולה זו נמשכת בדרך כלל 3-6 ימים.
4. הכינו 50 מ"ל של מדיום בידול מלא על ידי הוספת 5 מ"ל של תוסף ALI 10x, 500 מיקרוליטר של תוסף תחזוקה ALI, 100 מיקרוליטר של תמיסת הפרין ו-250 מיקרוליטר של תמיסת מלאי הידרוקורטיזון ל-44.15 מ"ל של מדיום בסיסי ALI.
5. הכינו CSE.
   1. מבעבעים סיגריה אחת דרך 12.5 מ"ל של מדיום בידול ולאחר מכן מסננים אותה דרך מסנן נקבוביות 0.22 מיקרומטר כדי להכין CSE. כדי להבטיח סטנדרטיזציה בין ניסויים ואצוות של CSE, למדוד את הספיגה ב 320 ננומטר על ספקטרופוטומטר ולהגדיר צפיפות אופטית (OD) של 1 כמו 100%⁸.
6. השתמש במדיום התמיינות המכיל ריכוז מתאים של CSE כדי לעורר תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה כדי לזהות השפעות על התמיינות התאים.
7. לאפשר לתאים להתמיין במשך 28 ימים, שבמהלכם משתנה המדיה התאית הבסיסית, והצד האפי נשטף פעמיים בשבוע על ידי הסרת המדיה התאית האפיקלית והחלפת המדיה התאית הבסיסית במדיום ההתמיינות המכיל את הריכוז המתאים של CSE.
8. נתח את התאים לאחר החשיפה.
   1. לאחר חשיפה למדיום התמיינות המכיל CSE, יש לקצור את התאים ואת הסופרנאטנטים של התרבית בכל נקודת זמן (כלומר, 0-28 ימים) לגילוי שינויים מורפולוגיים (כלומר, בדיקת אימונופלואורסנציה (IFA) או צביעת המטוקסילין-אאוסין (HE) או עבור הליכים אנליטיים ביואינפורמטיים (כלומר, תעתוק, פרוטאומיקה, מטבולומיקה וכו ').

תוצאות

בידול
תאי אפיתל של דרכי הנשימה התמינו בהצלחה לאחר תרבית בממשק אוויר-נוזל עם מדיום התמיינות במשך 28 ימים. נוכחותם של תאי ריסון וגביע הודגמה על ידי בדיקת אימונופלואורסנציה של סמן ריסונים אצטילאט α-טובולין (ירוק; איור 3A) וסמן תא הגביע Mucin5AC, בהתאמה6 (אדום; א?...

Discussion

COPD היא מחלה דלקתית כרונית נפוצה בדרכי הנשימה. חשיפה לעשן טבק מובילה לדלקת כרונית בדרכי הנשימה, לעיצוב מחדש של דרכי הנשימה ולהרס מבני של הריאות, שהוא תוצאה של אינטראקציה בין תאים מבניים שונים לבין תאי מערכת החיסון¹⁰. כקו הקדמי של מערכת החיסון המולדת בריאה, תאי אפיתל בדרכי הנשימה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050