In vitro Modell zur Untersuchung der Differenzierung und Veränderung von Multi-Omics an murinen Atemwegsepithelzellen, die mit Zigarettenrauchextrakt stimuliert wurden

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein in vitro Modell zur Isolierung und Differenzierung von murinen Atemwegsepithelzellen, wobei der Schwerpunkt auf ihrer Akklimatisierung an chronischen Zigarettenrauchextrakt (CSE) liegt. Das Modell könnte verwendet werden, um die Multi-Omics-Auswirkungen von CSE umfassend zu charakterisieren, was möglicherweise Einblicke in die zellulären Reaktionen unter chronischer Rauchbelastung liefert.

Zusammenfassung

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) wird weitgehend auf die Exposition gegenüber Tabakrauch zurückgeführt. Die Untersuchung, wie sich Epithelzellen der Atemwege funktionell an Tabakrauch anpassen, ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenese von COPD. In der vorliegenden Studie wurde ein in vitro-Modell mit primären Epithelzellen der Maus erstellt, um die Auswirkungen von Tabakrauch in der Praxis nachzuahmen. Im Gegensatz zu etablierten Zelllinien behalten Primärzellen eher in vivo-ähnliche Eigenschaften bei, einschließlich Wachstumsmuster, Alterung und Differenzierung. Diese Zellen weisen eine empfindliche Entzündungsreaktion und eine effiziente Differenzierung auf und bilden somit die physiologischen Bedingungen genau ab. In diesem Modell wurden primäre murine Atemwegsepithelzellen 28 Tage lang unter einer Luft-Flüssig-Grenzfläche mit einer optimalen Konzentration an Zigarettenrauchextrakt (CSE) kultiviert, was zur Umwandlung einer Monoschicht undifferenzierter Zellen in ein pseudostratifiziertes Säulenepithel führte, was auf eine CSE-Akklimatisierung hinweist. Umfassende Multi-Omics-Analysen wurden dann angewendet, um die Mechanismen aufzuklären, durch die CSE die Differenzierung der basalen Atemwegszellen beeinflusst. Diese Erkenntnisse ermöglichen ein tieferes Verständnis der zellulären Prozesse, die dem Fortschreiten der COPD als Reaktion auf Tabakrauch zugrunde liegen.

Einleitung

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine heterogene Lungenerkrankung mit komplexen Merkmalen, wobei Patienten mit COPD nach und nach jünger werden¹. Rauchen, ein primärer Risikofaktor für COPD², hat einen tiefgreifenden Einfluss auf die Epithelzellen der Atemwege, die als Ausgangsbarriere gegen Tabakrauch dienen. Trotz dieses bekannten Zusammenhangs sind die detaillierten Mechanismen, durch die Tabakrauch Veränderungen in den Epithelzellen der Atemwege hervorruft, nach wie vor unzureichend erforscht. Ein gründliches Verständnis dieser molekularen Veränderungen ist unerlässlich, um frühe diagnostische Ma....

Protokoll

Das Gesamtprotokoll erfordert 44 Tage, davon 1 Tag für die Präparation von Atemwegsepithelzellen, die aus murinen Luftröhren isoliert wurden, 15 Tage für die Zellproliferation und 28 Tage für die CSE-Stimulation an der Luft-Flüssig-Grenzfläche. Alle Versuchstiere sind im SPF Barrier Animal Room des Tierversuchszentrums der Capital Medical University untergebracht und wurden von der Ethikkommission für Tierversuche und Labortiere der Capital Medical University (AEEI-2020-100) überprüft und genehmigt, um die Anforderungen der ANARRIVE-Richtlinien⁷ zu erfüllen.

1. Isolierung von primären murinen Atemwegsepithelzel....

Diskussion

COPD ist eine häufige chronische Entzündungserkrankung der Atemwege. Die Exposition gegenüber Tabakrauch führt zu chronischen Entzündungen der Atemwege, einem Umbau der Atemwege und einer strukturellen Zerstörung der Lunge, die das Ergebnis des Zusammenspiels verschiedener Strukturzellen und Immunzellen ist¹⁰. Als Frontlinie des angeborenen Immunsystems in der Lunge spielen Epithelzellen der Atemwege eine sehr wichtige Rolle bei der Entwicklung der Krankheit¹¹. Vor di.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050