纳米原纤维基底膜模拟物，由重组功能化蜘蛛丝制成，用于定制组织培养小室

摘要

带有塑料膜的组织培养小室是细胞培养实验室的黄金标准，可作为建立细胞层和屏障组织模型的渗透性支持物。在此，我们提出了一种简单的方法，用由重组功能化蜘蛛丝蛋白制成的更具生物学相关性的膜代替塑料膜。

摘要

复制组织屏障对于生成用于评估新疗法的相关 体外 模型至关重要。今天，这通常使用带有塑料膜的组织培养插入物来完成，该插入物产生顶端和基底侧。除了为细胞提供支持外，这些膜还远非模拟它们的天然对应物基底膜，后者是一种基于蛋白质的纳米纤维基质。在这项工作中，我们展示了一种简单的方法，通过用纯重组功能化蜘蛛丝蛋白制成的塑料膜代替塑料膜来显着提高组织培养插入物的生物学相关性。丝膜通过自组装形成，并会自发粘附在无膜的组织培养插入物上，在那里它可以为细胞提供支持。可以按照实验方案中提供的说明使用标准 3D 打印机打印定制设计的组织培养插入物，也可以购买并使用商业插入物。该方案展示了如何设置插入片段中带有丝膜的培养系统，以及随后如何实施与传统的市售插入片段相同的细胞培养技术。

引言

可以复制组织屏障的体外模型因其在测试新疗法和促进对基本疾病机制的理解方面的适用性而受到越来越多的关注 ^1,2。为了准确重建天然微环境，概括基底膜 （BM） 的功能至关重要，BM 是一种高度专业化的细胞外基质 （ECM） 复合物。BM 几乎存在于人体的每个组织中，它为内皮细胞和上皮细胞提供支持，并将它们与底层组织分离 ^2,3。除了提供物理支持外，BM 还调节和维持细胞与周围组织之间的生化信号。这些重要功能使得设计类似于天然 BM³ 的结构以及机械和功能特性的支架变得必要。

当今在体外模拟 BM 的最常见方法之一是使用市售的组织培养插入片段 （TC-inserts）。这些本质上是塑料圆柱体，带有可渗透膜，将腔室分为顶端和基底外侧 ^4,5。虽然易于使用，但商业插件中的膜通常是刚性的、径迹蚀刻的，并且由聚碳酸酯 （PC） 和聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET） 等聚合物制成^3,4,6。它们在直径、孔密度和尺寸方面具有柔韧性，可以涂覆以增强细胞粘附，但缺乏 BM 的所有其他相关特性，例如可比的厚度⁶、互连孔隙率、纤维结构和相关的弹性模量³。

TC 插入物的标准化及其易用性激发了包括我们在内的几个小组用更像体内的对应物取代塑料膜（如表 1 所示）。使用的材料范围从聚二甲基硅氧烷 （PDMS）⁷、聚（丙交酯-共己内酯）⁸ 和聚己内酯 （PCL）^4,9,10 等聚合物到蛋白质材料，如明胶 ^2,11,12、胶原蛋白 ^5,13 和重组蜘蛛丝 14,15,16,17.这些材料的膜以各种方式附着在市售的插入物上，从中去除了膜 4,7,8,10,12,13,14,16,18,19,20,21 ，以及通过 3D 打印 ^{1,11,15,17,20} 或注塑成型 ^9,22 制造的定制设计嵌件。然而，这些中的大多数在厚度上仍然与原生 BM 相去甚远，那里的复制品从数百微米^11,18 到几微米 ^{5,10,14,21,22} 不等。其中许多还需要复杂的形成和/或手动连接方法 1,7,13,14,18,19,21，这使得其他实验室的放大和复制具有挑战性。

在此，我们提出了一种简单的方法来形成丝膜并将其连接到插入物上，并展示了如何在膜的任一侧培养细胞。丝膜是通过 FN-4RepCT （FN-silk） 蛋白在静置溶液的液-气界面处自组装形成^{的 16,17}。FN 丝是来自 Euprosthenops australis 的 Major Ampullulate Spidroin 1 的重组短版本，用源自纤连蛋白²³ 的 RGD 基序功能化。它已被证明可以组装成纤维状基质，促进细胞粘附、生长和迁移 15,16,17,23,24,25。膜附着在嵌件上的方法依赖于自发粘附，并且已被发现适用于已去除膜的市售嵌件¹⁶，以及聚乳酸 （PLA） ¹⁷ 和 Dental LT¹⁵ 的 3D 打印嵌件。本文详细介绍了如何将这种方法用于从 Dental LT 打印的嵌件。FN 丝膜附着到插入片段上后，它们基本上可以像标准商业组织培养插入片段一样处理。简而言之，我们提出了一种简单的方法，通过用基于蛋白质的 FN 丝膜代替塑料膜来生成更相关的组织屏障体外模型。

研究方案

1. 3D 刀片印刷

1. 下载 . 补充文件 1 中的 STL 设计文件 （JoVe_Silk_Insert.stl）。
2. 通过在专用于转换 .STL 文件转换为正在使用的 3D 打印机的打印文件。
3. 使用专用软件添加支持。支撑结构由软件设计，所需数量取决于打印机和所使用的软件。调整嵌件的方向，使建筑平台和支撑都不会接触底部。
4. 使用适合所用 3D 打印机的生物相容性树脂（如 Dental LT 或 BioMed）或细丝（如 PLA）打印所需数量的插入物。
   注意：确保材料能够承受适当的灭菌过程，例如高压灭菌、辐照或乙醇浸没。
5. 从打印平台上拆下打印的插页，并从成品部件上拆下打印的支撑结构。
6. 如果使用树脂打印机，请使用制造商提供的标准方案处理插入片段。
   注：加工可能会因使用的树脂而异。用于此处使用的树脂的方案在 补充文件 2 中提供。
7. 使用适合所选材料的技术对插入物进行消毒。
   注：建议进行高压灭菌、辐照或浸没在 70% 乙醇中，或两者的组合。如果使用树脂打印机，则可能需要广泛的浸出方案以实现最佳生物相容性。有关建议，请参阅 补充文件 2 中提供的协议。
8. 确保插件完全干燥，并以无菌方式存放直至使用。

2. FN 丝膜的形成

1. 用干冰装满一个盒子，然后将其放入 -80 °C 冰箱中。
2. 从 -80 °C 冰箱中收集 FN-silk 样品瓶，并将其放入干冰中运输。将 FN-silk 样品瓶带到生物安全柜中，并在那里执行进一步的步骤。将 FN-silk 样品瓶放在微量离心管架中解冻，不要过度接触。
3. 在 FN-silk 解冻时，打开 48 孔板的包装。FN 丝完全解冻后，请在 10 分钟内进行下一步，最好尽早进行。
4. 在冷藏或室温 PBS 中将 FN-silk 溶液稀释至所需浓度，最好为 1.8 mg/mL。将 550 μL FN-silk 溶液直接移液到 48 孔板中空孔的底部。移液 FN-silk 溶液，直到制备出所需数量的膜。
   注意：避免引入气泡，并立即用移液器去除任何气泡。不要使用 A 行或 F 行或第 1 列或第 8 列中的孔，也不要使用相邻的孔（参见 补充图 S1 中的示意图）。
5. 将盖子放在 48 孔板上，并将其放入更大的无菌盒中，以便在孵育过程中提供无菌环境。
6. 小心地将盒子从生物安全柜中移出，并将其置于环境条件下不受干扰且没有明显气流的地方过夜。

3. 将 FN 丝膜粘附到插入物上

1. 第二天，将无菌插入物带到生物安全柜。
2. 将装有 48 孔板和 FN-silk 膜的大无菌盒带回生物安全柜中，并在那里执行进一步的步骤。小心地从大无菌盒中取出 48 孔板。
3. 通过观察孔中的浑浊情况目视验证膜的形成，然后打开包含膜的 48 孔板的盖子。使用无菌镊子拿起一个插入物，然后将插入物向下引导到膜上，直到插入物的手柄接触孔的顶部，如图 1 所示。保持插件底部与板底部平行。
4. 重复步骤 3.3，直到插入物下降到所有形成的膜上。将盖子放在 48 孔板的顶部，然后将板放回无菌盒中。在环境条件下让板不受干扰 2 小时，以使膜粘附在插入物上。
5. 在 37 °C 下预热生长培养基或 PBS。
6. 打开 24 孔板的包装。
7. 2 小时后，从盒子中取出 48 孔板并打开盖子。使用无菌镊子握住插入物的手柄，然后将其从 48 孔板中取出。
8. 提升后，立即用预热的培养基或 PBS 填充插入物。如果进行基底侧接种，则使用 100 μL 培养基，如果进行根尖侧接种，则使用 200 μL 培养基。如果要储存膜以备后用，请改用 200 μL PBS。
   检查点：如果液体保留在膜上方，则提升成功。如果液体滴到工作台上，则膜会泄漏，应忽略。
9. 将插件放入 24 孔板的空孔中。
10. 将所有插件从 48 孔板中取出并转移到 24 孔板中。如果进行细胞接种，则用 1,000 μL 生长培养基填充孔，如果进行细胞接种，则用 PBS 填充孔，同时保持板略微倾斜。
    注意：膜的边缘低于液位很重要（图 2）。
11. 如果要立即接种细胞，请根据细胞要接种的膜的哪一侧进行第 4 部分或第 5 部分。如果没有，请将盖子放在 24 孔板上，然后将其放入冰箱 （4 °C） 或 37 °C 培养箱中。如果放入培养箱中，每隔一天补充一次 PBS，以确保维持所需的体积。

4. 细胞接种在膜的顶端侧

注：如果膜已储存在 PBS 中，请按照第 6 节所述用预热的培养基更换 PBS。

1. 收获细胞。准备细胞悬液，使 20-50 μL 的悬浮液中存在每个膜所需的细胞数。重悬以达到所需的细胞浓度。
2. 使用 P100 或 P200 移液器，吸出 20-50 μL 细胞悬液。将移液器吸头对准膜中心，使吸头与插入物内的培养基表面保持 1-2 mm 的距离，然后缓慢按下移液器柱塞，在吸头边缘形成液滴。使液滴与插入管内的培养基接触。
   注意：保持移液器垂直于工作表面。
3. 对剩余的膜重复步骤 4.2。接种 5 个膜后重悬细胞原液，以确保细胞分布均匀。以 8 字形移动板，以确保细胞在膜上分布更好。
4. 在标准条件（37 °C 和 5% CO₂ ）下培养，并每隔一天更换一次培养基。

5. 细胞接种在膜的基底侧

注：如果膜已储存在 PBS 中，请用 100 μL 预热的生长培养基替换 PBS，并按照第 6 节所述用 1 mL 预热的生长培养基填充孔。

1. 收获细胞并制备细胞悬液，使 20 μL 悬浮液中每层膜的细胞数达到所需数量。重悬以达到所需的细胞浓度。
2. 打开培养皿的包装并打开盖子。确保培养皿的高度足以容纳插入物，而不会使它们的底部接触盖子。
3. 使用镊子将插入物从 24 孔板中取出，将培养基留在孔中。每只手使用一组镊子，将插入物倒置，使基部朝上，顶端朝向工作区域。如图 3C 所示，将倒置的插件放入培养皿中。对其余插入重复上述步骤。
   注意：请勿去除顶端侧的培养基。它将在孵育过程中保持膜湿润。
4. 重悬细胞原液以确保细胞在溶液中分布均匀，并用 P100 或 P200 移液器吸出 20 μL 细胞悬液。将移液器吸头对准膜中心，使吸头与膜保持 1-2 mm 的距离，然后缓慢按下移液器柱塞，在吸头边缘形成液滴。保持移液器垂直于膜表面，让液滴落到膜上。对剩余的膜重复此操作。
   注：接种 5 个膜后重悬细胞原液，以确保细胞分布均匀。
5. 盖上培养皿的盖子，将培养皿和 24 孔板带到培养箱中，并在标准条件（37 °C 和 5 % CO_{2 ）}下将插入物与细胞孵育 30 分钟。
6. 将含有培养基和培养皿的 24 孔板带入生物安全柜中。打开两个盖子，每只手使用一组镊子，拿起一个插入物并将其倒置，使膜的顶端侧现在朝上，基底侧朝下。
7. 使用 P200 移液器，在插件内添加 200 μL 培养基。将插入物放入 24 孔板的其中一个预装孔中，然后对剩余的膜重复此操作。
8. 在标准条件（37 °C 和 5% CO₂ ）下培养，并每隔一天更换一次培养基。

6. 浸没条件下培养物的培养基变化

1. 添加 1,000 μL/孔，用新鲜培养基制备新的 24 孔板。使用镊子从 24 孔板中取出一个插入物，稍微倾斜，然后从顶端取出培养基。
2. 在插入物中加入 200 μL 新鲜培养基。将插入物放入预装有新鲜培养基的孔中。对所有膜重复此操作。

7. 空运条件下培养基培养基

1. 使用镊子提起插件并将其放入 24 孔板的空孔中。对另外四个膜重复此操作。
2. 稍微倾斜 24 孔板，并在每个板孔内缓慢添加 1,000 μL 新鲜培养基。对剩余的膜重复此操作。

8. 测量跨上皮电阻 （TEER）

1. 准备一个 24 孔板，孔内装有 1,000 μL 培养基或 PBS，然后将膜转移到其中。确保在膜上方有 200 μL 的相应溶液。
2. 使用一组镊子，轻轻按压插入臂，将插入管板内部稳定下来。在不取下镊子的情况下，将 TEER 电极插入孔中并记录测量结果。
3. 取下电极，然后提起镊子。
4. 对剩余的膜重复步骤 8.2-8.3。

讨论

本文描述的方案概述了一种制备生物学相关细胞培养插入物的简单方法。它从打印插入片段开始，然后是 FN 丝膜的形成和附着，最后展示了细胞如何在膜的顶端和基底侧接种。该方案中有一个真正关键的步骤是确保细胞培养的长期成功，那就是将插入物降低和提升到膜上。成功执行这些步骤将产生能够承受细胞培养的丝膜插入培养系统，类似于具有合成膜的市售系统。为了确保这一点，在定制设计的嵌件的侧面安装了导轨，以防止它们在井中倾斜下降或侧向移动，这会导致膜粘附不均匀，产生薄弱点并随后泄漏。第一次遵循协议时出现小问题是很常见的。为了帮助新用户规避这些问题，如果他们在遵循上述协议时遇到这些问题，我们在 表 3 中概述了潜在问题及其解决方案。

膜本身已被证明有利于模拟不同的屏障组织（如 表 2 中概述）;然而，应该指出的是，用于打印此处插入片段的树脂尚未对其对其他细胞类型活力的影响进行广泛测试。虽然到目前为止我们还没有遇到任何此类问题，但树脂可能会对一些敏感细胞的活力和生长产生负面影响。因此，建议进行类似于此处介绍的活力测试，以验证填料与所用每种细胞类型的相容性。如果出现细胞毒性，应建立更彻底的固化和/或浸出方案，以防止未固化的单体随着时间的推移而浸出并伤害细胞。可以在 补充文件 2 中找到这种方案的示例，该方案用于打印该方案中用于打印插入片段的树脂。该方案以前已用于制备用于在丝膜上培养 bEnd.3 脑内皮细胞长达 8 天的插入片段¹⁵。

本研究中介绍的方法的主要优点是，它提供了一种简单的方法来替换组织培养插入物上的当前塑料膜，从而改善静态组织培养模型。主要限制是用户需要使用 3D 打印设备或在设施中购买时间来打印他们的插页。然而，如有必要，可以通过在去除膜后使用市售组织培养插入物来规避这种情况。此外，虽然丝膜本质上可以用作常规的组织培养插入物，但它们更薄且具有蛋白质成分，因此比目前的合成商业同类产品更敏感。因此，它们需要用户更小心地处理，并且需要保持湿润以保持其弹性。应该注意的是，膜可以承受拉伸和充气^16,17，使其适用于模拟呼吸运动等。即便如此，新用户很可能会在初始阶段破坏一些膜，但随着他们的膜处理经验的增加，预计成功率会提高。如果问题仍然存在，用户应参考表 3 进行故障排除。

在过去的十年中，已经提出了几种商业塑料插入物的替代品（表 1），每次比较细胞培养物的性能时，新的、更具生物学相关性的膜都比商业塑料膜产生更好的结果 2,5,6,7,14,22。这主要体现在增强的屏障功能方面 2,5,6,7,14,22，但也体现在形成更像天然的细胞生长¹⁴ 和在共培养系统中通过膜的相互作用增加 7 .以前在建立血管壁模型时，FN 丝膜已经观察到了这种趋势。在这项研究中，HDMEC 和平滑肌细胞 （SMC） 生长在膜的相对两侧。结果表明，与市售 PET 膜相比，SMC 在 FN 丝膜上与 HDMEC 共培养时分泌更厚的 ECM。同样，HDMEC 在 FN 丝膜上建立了更紧密的屏障¹⁷。细胞培养结果的改善可能是由于细胞通讯的改善和更多的体内类似培养条件。FN 丝膜在厚度、结构和机械性能方面更接近天然 BM。天然 BM 在 20 nm 到 3 μm 之间，^{薄 22} 英寸，PET 膜为 10 μm，FN 丝膜约为 1 μm，因此完全属于天然范围。FN 丝膜的结构也是纳米纤维¹⁶，就像天然 BM²² 一样，而 PET 膜由带有轨迹蚀刻孔的塑料组成，直径通常在 0.4 μm 到 8 μm^{之间 7}。PET 膜的刚性也比 BM 高得多，杨氏模量约为 2 GPa，而 BM 的模量范围为 kPa 至 MPa，但通常约为 250-500 kPa²²。FN 丝膜的杨氏模量为 115 kPa¹⁶，属于天然条件。还应该注意的是，一旦细胞在膜上生长，它们的强度就成为主导因素，而不是膜本身¹⁷。最后，还应该注意的是，FN 丝蛋白的集成功能化确保细胞直接粘附在膜上，因此不需要涂层。对于 PET 膜，通常标配的是涂覆 ECM 蛋白以确保适当的细胞粘附⁷。

当将 FN 丝膜与用于替代 PET 膜的其他方法进行比较时（如 表 1 所示），我们方法的主要优点是使用重组生产的功能化丝蛋白。这确保了可重复性和确定的培养条件，与其他基于蛋白质的动物源性材料（如胶原蛋白）相比。再次注意，蛋白质的功能化确保不需要涂层，因为细胞可以很好地粘附在膜上，因为它是¹⁷。此外，本文描述的丝基膜的生产基于自组装，不需要任何复杂的设置或使用刺激性化学品，这与许多其他依赖于静电纺丝的技术不同。膜自发粘附到小室上，也无需与两部分小室、胶合和硅安装环相关的手动操作，从而简化了放大，并在任何实验室中实现轻松的可重复性。除了简单的生产外，我们的方法还很容易适应用户的实验需求，因为可以使用不同的插入材料，并且可以通过调整初始溶液的丝浓度来调整膜厚度¹⁶。最后，据我们所知，该方案可以产生迄今为止附着在组织培养插入物上的最薄的独立膜，从而与天然基底膜最相似。

这里介绍的丝膜形成和处理方案对于习惯于在细胞培养实验室中使用组织培养小室的任何人来说都很容易使用。这是一种从塑料膜过渡到更像 体内的简单方法，它允许使用各种类型的细胞生成更相关的组织模型（表 2）。丝膜可以支持其顶端或基底侧的细胞培养以及双侧不同细胞类型的共培养¹⁷。在丝膜上开发的屏障组织模型可用于与组织培养插入物相同的应用范围，包括药物筛选以及渗透和感染研究。对于不同细胞类型之间的串扰值得关注的情况，由于它们在 体内更相似的特性，它们已被证明优于 TC 插入片段¹⁷。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHEMICALS
Alexa Fluor 488	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	A-21121	Goat anti-mouse, Dilution 1:500
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	A12379	Dilution 1:400
anti-ZO-1 (1A12) antibody	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	33-9100	Mouse anti-human, Monoclonal, Dilution 1:200
Dextran, Alexa Fluor 680; 3,000 MW, Anionic	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	D34681	Diluted 2,5% (w/v) in 200 ul of culture medium
DMEM/F-12	Gibco; Thermo Fisher Scientific	31330095	Supplemented with 5% v/v FBS and 1% v/v Penicillin-Streptomycin
Ethanol	Solveco	1326	70% (CAS-no 64-17-5)
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, United States	Gibco; Thermo Fisher Scientific	16140071
FN-silk	Spiber technologies AB		Store at -80 °C
Isopropanol, EMPARTA ACS analytical reagent	Supelco	1096342511	≥99.5% (CAS-no 67-63-0)
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen; Thermo Fisher Scientific	L3224
PBS	Swedish Veterinary Agency / Statens veterinärmedicinska anstalt	992420	without Ca and Mg, filtered
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco; Thermo Fisher Scientific	11548876
MATERIAL
Dental LT Clear Resin	Denthouse	#DLCL-01
HaCaT cells	CLS	300493
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24-well	Fisher Scientific	10604903
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 48-wel	Fisher Scientific	10644901
TC insert, for 24-well plates, PET, transparent	Sarstedt	83.3932.041	pore size: 0.4 µm
ThinCert Cell Culture Inserts, translusent membrane (PET)	Greiner	662640	pore size: 0.4 µm
EQUIPMENT
EVOM meter with chopsticks	World Precision Instruments (WPI) Germany, GMBH
Form 3B	FormLabs
Form Wash	FormLabs
Form Cure	FormLabs
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisherbrand
Inverted fluorescence microscope Eclipse Ti	Nikon
Inverted fluorescence microscope DMI6000 B	Leica
Laminar flow hood Ninosafe, class II	Labolutions
Midi CO2 Incubator, 40 L	Thermo Scientific