通过基于 SV40 的人游离体内易结构 DNA 重复序列的电泳分析进行复制

摘要

在这里，我们概述了使用 2 维凝胶电泳通过致病性、易结构重复分析复制进程的程序。

摘要

二维中性/中性凝胶电泳 （2DGE） 成为分析通过自然障碍进行 DNA 复制的基准技术。该方案描述了如何通过人类细胞中基于猿猴病毒 40 （SV40） 的附加体内易结构、可扩增的 DNA 重复序列分析复制叉进程。简而言之，在质粒转染到人细胞中后，通过改良的 Hirt 方案分离复制中间体，并用 DpnI 限制性内切酶处理以去除未复制的 DNA。然后用适当的限制性内切酶消化中间体，将目标重复序列置于 3-5 kb 长的 DNA 片段的起点远端半部分内。复制中间体分为两个垂直维度，首先按大小，然后按形状。在 Southern 印迹杂交之后，这种方法允许研究人员在复制 Y 弧的下半部分观察到各种结构形成重复的叉停滞。此外，stall 站点的这种定位允许可视化重复介导的 fork stalling 的各种结果，例如分叉反转、收敛分叉的出现和重组分叉重启。

引言

短串联重复序列 （STR） 是小的、通常为 2-9 个碱基对 （bp） 的重复 DNA 序列，约占人类基因组的 3%¹。STR 在基因调控中起重要作用²;然而，它们的重复组成使它们容易形成非经典 DNA 二级结构并随后出现遗传不稳定性 ^3,4。从左旋螺旋到发夹/十字形，再到三链和四链螺旋，这些替代 DNA 结构对复制体造成了内在挑战。二级结构形成的自然先决条件是 DNA 解旋，这是 DNA 复制的先决条件。这给基因组功能带来了一个独特的难题，因为许多这些结构会在复制过程中形成，阻碍复制体的进展，并最终导致复制叉停滞 ^5,6,7，或者在严重的情况下，导致叉崩溃和 DNA 断裂 ^8,9。停滞分叉的重新启动和 DNA 修复途径已被证明都会导致重复不稳定性，例如重复扩增^10,11

研究方案

注意：为我们在哺乳动物细胞中概述的 2DGE 分析而设计的质粒应包含易结构重复序列上游几 kb 的 SV40 复制起点（图 2）。在选择相对于起始点的方向时，应牢记先导合成和滞后合成，重复序列应克隆到质粒中。

图 2：用于 2DGE 分析的含重复序列质粒的消化。 结构易重复序列描绘在右移动复制叉下游几 kb 处。使用独特的切割器 1 和 2 进行消化会将重复序列放在 Y 弧的下降臂上，因为序列超出了消化片段的中点。缩写：2DGE = 二维中性/中性凝胶电泳。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

2DGE 提供了特定序列复制过程中出现的中间体相对群体的半定量和综合图像。鉴于在整个过程中必须保持复制叉的脆弱分子结构，因此应非常小心地防止物理剪切和化学变性。因此，强烈建议在质粒分离过程中避免任何碱性处理。为避免这种情况，我们和其他人实施了 Hirt 于 1967 年建立的 Hirt DNA 分离的改良形式³³。在这里，通过在 4 °C 下用 1 M NaCl 处理?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cells	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	BP82031GAL
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-5
Ruler	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Sodium dodecyl sulfate	Millipore Sigma	436143-25G
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056