Análisis electroforético de la replicación a través de repeticiones de ADN propensas a la estructura dentro del episoma humano basado en SV40

Resumen

Aquí, describimos el procedimiento para analizar la progresión de la replicación a través de repeticiones patógenas propensas a la estructura utilizando electroforesis en gel bidimensional.

Resumen

La electroforesis bidimensional en gel neutro/neutro (2DGE) surgió como una técnica de referencia para analizar la replicación del ADN a través de impedimentos naturales. Este protocolo describe cómo analizar la progresión de la horquilla de replicación a través de repeticiones de ADN expandibles y propensas a la estructura dentro del episoma basado en el virus del simio 40 (SV40) en células humanas. En resumen, tras la transfección de plásmidos en células humanas, los intermedios de replicación se aíslan mediante el protocolo Hirt modificado y se tratan con la enzima de restricción DpnI para eliminar el ADN no replicado. A continuación, los intermedios son digeridos por enzimas de restricción apropiadas para colocar la repetición de interés dentro de la mitad distal de origen de un fragmento de ADN de 3-5 kb de largo. Los intermedios de replicación se separan en dos dimensiones perpendiculares, primero por tamaño y luego por forma. Después de la hibridación de Southern blot, este enfoque permite a los investigadores observar el estancamiento de la horquilla en varias repeticiones de formación de estructuras en la mitad descendente del arco Y de replicación. Además, este posicionamiento del sitio de pérdida permite la visualización de varios resultados del estancamiento de la horquilla mediado por repetición, como la inversión de la horquilla, el advenimiento de una horquilla convergente y el reinicio recombinante de la horquilla.

Introducción

Las repeticiones cortas en tándem (STR) son secuencias repetitivas de ADN pequeñas, normalmente de 2 a 9 pares de bases (bp), que constituyen alrededor del 3%^{del genoma humano}. Los STR juegan un papel importante en la regulación génica²; sin embargo, su composición repetitiva los hace propensos a la formación de estructuras secundarias de ADN no canónicas y a la posterior inestabilidad genética ^3,4. Desde las hélices levógiras hasta las horquillas/cruciformes, pasando por las hélices de tres y cuatro hebras, estas estructuras alt....

Protocolo

NOTA: El plásmido diseñado para nuestro análisis 2DGE descrito en células de mamíferos debe contener un origen de replicación SV40 varios kb aguas arriba de las repeticiones propensas a la estructura (Figura 2). Se debe tener en cuenta la síntesis inicial y retrasada al elegir qué orientación en relación con el origen deben clonarse las repeticiones en el plásmido.

Figura 2: D....

Resultados

Si tiene éxito, tras la visualización, se puede observar un arco agudo de horquillas de replicación que se extiende hacia arriba y hacia afuera desde el punto masivo 1n (Figura 5A). El tamaño de un fragmento, o el porcentaje que se replica, determina la movilidad del fragmento en la primera dimensión. A medida que los intermedios desarrollen una estructura más articulada, comenzarán a viajar más lentamente en la segunda dimensión. Por lo tanto, si u.......

Discusión

2DGE proporciona una imagen semicuantitativa y completa de las poblaciones relativas de intermedios que surgen durante la replicación de una secuencia particular. Dado que las frágiles estructuras moleculares de las horquillas de replicación deben mantenerse durante todo este procedimiento, se debe tener mucho cuidado para evitar el cizallamiento físico y la desnaturalización química. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente evitar cualquier tratamiento alcalino durante el aisla.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cells	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	BP82031GAL
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-5
Ruler	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Sodium dodecyl sulfate	Millipore Sigma	436143-25G
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056