Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем процедуру анализа прогрессии репликации через патогенные, склонные к структуре повторы с использованием 2-мерного гель-электрофореза.

Аннотация

Двумерный нейтральный/нейтральный гель-электрофорез (2DGE) стал эталонным методом анализа репликации ДНК через естественные препятствия. В этом протоколе описывается, как анализировать прогрессирование репликационной вилки через склонные к структуре, расширяемые повторы ДНК в эписоме на основе вируса обезьян 40 (SV40) в клетках человека. Вкратце, при трансфекции плазмиды в клетки человека промежуточные продукты репликации выделяют по модифицированному протоколу Hirt и обрабатывают ферментом рестрикции DpnI для удаления нереплицированной ДНК. Затем промежуточные продукты расщепляются соответствующими ферментами рестрикции, чтобы поместить интересующий их повтор в исходную дистальную половину фрагмента ДНК длиной 3-5 кб. Промежуточные продукты репликации разделены на два перпендикулярных измерения, сначала по размеру, а затем по форме. Следуя гибридизации методом Саузерн-блот, этот подход позволяет исследователям наблюдать остановку вилки при различных структурообразующих повторах на нисходящей половине Y-дуги репликации. Кроме того, такое расположение места остановки позволяет визуализировать различные результаты остановки вилки, опосредованной повторами, такие как реверсирование вилки, появление сходящейся вилки и рекомбинационный перезапуск вилки.

Введение

Короткие тандемные повторы (STR) представляют собой небольшие, обычно 2-9 пар оснований (.о.), повторяющиеся последовательности ДНК, которые составляют около 3% генома человека. STR играют важную роль в регуляции генов2; однако их повторяющийся состав делает их склонными к образованию неканонических вторичных структур ДНК и последующей генетической нестабильности 3,4. От левосторонних спиралей до шпилек/крестообразных, до трех- и четырехцепочечных спиралей, эти альтернативные структуры ДНК вызывают внутренние проблемы для репсомы....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида, разработанная для нашего описанного нами анализа 2DGE в клетках млекопитающих, должна содержать источник репликации SV40 на несколько кб выше склонных к структуре повторов (рис. 2). Опережающий и запаздывающий синтез следует иметь в виду при выборе ориентации относительно происхождения повторов в плазмиду.

figure-protocol-490
Рисунок 2: Расщепление плазмиды, содержащей повто....

Результаты

В случае успеха, при визуализации, можно наблюдать острую дугу репликационных вилок, простирающуюся вверх и наружу от массивного пятна 1n (рисунок 5A). Размер фрагмента, или процент репликации, определяет подвижность фрагмента в первом измерении. По мере.......

Обсуждение

2DGE обеспечивает полуколичественное и всеобъемлющее изображение относительных популяций промежуточных продуктов, возникающих при репликации той или иной последовательности. Учитывая, что хрупкие молекулярные структуры репликационных вилок должны поддерживаться ?.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы благодарим Хорхе Себриана и Анастасию Растокину, которые начали разрабатывать этот подход в нашей лаборатории, Массимо Лопеса за предоставленную нам плазмиду pML113 и бесценные советы, Илли Доксани за содержательные дискуссии и сотрудников лаборатории Миркина за их поддержку. Работа в лаборатории Миркина поддерживается Национальным институтом общих медицинских наук [R35GM130322] и NSF-BSF [2153071].

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10x TBE BufferBio Rad1610733
20x SSC BufferFisher ScientificBP1325-1
293T cellsATCCCRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol RevvityBLU512H250UC
AgaroseFisher ScientificBP160-500
Amersham Hybond-N+Fisher ScientificRPN303B
BAS Storage Phosphor ScreensFisher Scientific28956482
Church and Gibert's hybriddization bufferFisher Scientific50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kitThermoFisher ScientificK0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvateThermoFisher Scientific10569010
DpnINew England BiolabsR0176SAdditional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8Fisher ScientificBP2482500
Ethanol, 70%Fisher ScientificBP82031GAL
Fetal Bovine Serum VWR97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 MMillipore Sigma13-1683
IsopropanolFisher ScientificBP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with BufferVWR101000027
MycoZap Plus-CLVWR75870-448
NaClMillipore Sigma746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge TubesThermoFisher Scientific3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5ThermoFisher Scientific10010024
Proteinase KThermoFisher ScientificEO0491
Proteinase KThermoFisher ScientificEO0492
Pure Cellulose Chromatography PaperFisher Scientific05-714-4
Pure Cellulose Chromatography PaperFisher Scientific05-714-5
RulerFisher Scientific09-016
ScalpelFisher Scientific12-460-451
Sodium dodecyl sulfateMillipore Sigma436143-25G
Sodium hydroxideFisher ScientificS25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed CentrifugeThermoFisher Scientific75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis SystemBio Rad1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket RotorThermoFisher Scientific75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5Fisher ScientificBP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermoFisher Scientific25200056

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены