Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Здесь мы описываем процедуру анализа прогрессии репликации через патогенные, склонные к структуре повторы с использованием 2-мерного гель-электрофореза.
Двумерный нейтральный/нейтральный гель-электрофорез (2DGE) стал эталонным методом анализа репликации ДНК через естественные препятствия. В этом протоколе описывается, как анализировать прогрессирование репликационной вилки через склонные к структуре, расширяемые повторы ДНК в эписоме на основе вируса обезьян 40 (SV40) в клетках человека. Вкратце, при трансфекции плазмиды в клетки человека промежуточные продукты репликации выделяют по модифицированному протоколу Hirt и обрабатывают ферментом рестрикции DpnI для удаления нереплицированной ДНК. Затем промежуточные продукты расщепляются соответствующими ферментами рестрикции, чтобы поместить интересующий их повтор в исходную дистальную половину фрагмента ДНК длиной 3-5 кб. Промежуточные продукты репликации разделены на два перпендикулярных измерения, сначала по размеру, а затем по форме. Следуя гибридизации методом Саузерн-блот, этот подход позволяет исследователям наблюдать остановку вилки при различных структурообразующих повторах на нисходящей половине Y-дуги репликации. Кроме того, такое расположение места остановки позволяет визуализировать различные результаты остановки вилки, опосредованной повторами, такие как реверсирование вилки, появление сходящейся вилки и рекомбинационный перезапуск вилки.
Короткие тандемные повторы (STR) представляют собой небольшие, обычно 2-9 пар оснований (.о.), повторяющиеся последовательности ДНК, которые составляют около 3% генома человека. STR играют важную роль в регуляции генов2; однако их повторяющийся состав делает их склонными к образованию неканонических вторичных структур ДНК и последующей генетической нестабильности 3,4. От левосторонних спиралей до шпилек/крестообразных, до трех- и четырехцепочечных спиралей, эти альтернативные структуры ДНК вызывают внутренние проблемы для репсомы....
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида, разработанная для нашего описанного нами анализа 2DGE в клетках млекопитающих, должна содержать источник репликации SV40 на несколько кб выше склонных к структуре повторов (рис. 2). Опережающий и запаздывающий синтез следует иметь в виду при выборе ориентации относительно происхождения повторов в плазмиду.
Рисунок 2: Расщепление плазмиды, содержащей повто....
В случае успеха, при визуализации, можно наблюдать острую дугу репликационных вилок, простирающуюся вверх и наружу от массивного пятна 1n (рисунок 5A). Размер фрагмента, или процент репликации, определяет подвижность фрагмента в первом измерении. По мере.......
2DGE обеспечивает полуколичественное и всеобъемлющее изображение относительных популяций промежуточных продуктов, возникающих при репликации той или иной последовательности. Учитывая, что хрупкие молекулярные структуры репликационных вилок должны поддерживаться ?.......
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Мы благодарим Хорхе Себриана и Анастасию Растокину, которые начали разрабатывать этот подход в нашей лаборатории, Массимо Лопеса за предоставленную нам плазмиду pML113 и бесценные советы, Илли Доксани за содержательные дискуссии и сотрудников лаборатории Миркина за их поддержку. Работа в лаборатории Миркина поддерживается Национальным институтом общих медицинских наук [R35GM130322] и NSF-BSF [2153071].
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x TBE Buffer | Bio Rad | 1610733 | |
20x SSC Buffer | Fisher Scientific | BP1325-1 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol | Revvity | BLU512H250UC | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Amersham Hybond-N+ | Fisher Scientific | RPN303B | |
BAS Storage Phosphor Screens | Fisher Scientific | 28956482 | |
Church and Gibert's hybriddization buffer | Fisher Scientific | 50-103-5408 | |
DecaLabel DNA labeling kit | ThermoFisher Scientific | K0622 | |
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 10569010 | |
DpnI | New England Biolabs | R0176S | Additional restriction enzymes will need to be purchased as well |
EDTA 0.5 M, pH 8 | Fisher Scientific | BP2482500 | |
Ethanol, 70% | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Hydrochloric acid solution, 12 M | Millipore Sigma | 13-1683 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer | VWR | 101000027 | |
MycoZap Plus-CL | VWR | 75870-448 | |
NaCl | Millipore Sigma | 746398-500G | |
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 3139-0050 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5 | ThermoFisher Scientific | 10010024 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0491 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | EO0492 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-4 | |
Pure Cellulose Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
Ruler | Fisher Scientific | 09-016 | |
Scalpel | Fisher Scientific | 12-460-451 | |
Sodium dodecyl sulfate | Millipore Sigma | 436143-25G | |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S25548 | |
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75006580 | |
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad | 1704401 | |
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003010 | |
Tris-HCl 1 M, pH 7.5 | Fisher Scientific | BP1757-500 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены