Электрофоретический анализ репликации через структурно-склонные повторы ДНК в эписоме человека, основанной на SV40

Резюме

Здесь мы описываем процедуру анализа прогрессии репликации через патогенные, склонные к структуре повторы с использованием 2-мерного гель-электрофореза.

Аннотация

Двумерный нейтральный/нейтральный гель-электрофорез (2DGE) стал эталонным методом анализа репликации ДНК через естественные препятствия. В этом протоколе описывается, как анализировать прогрессирование репликационной вилки через склонные к структуре, расширяемые повторы ДНК в эписоме на основе вируса обезьян 40 (SV40) в клетках человека. Вкратце, при трансфекции плазмиды в клетки человека промежуточные продукты репликации выделяют по модифицированному протоколу Hirt и обрабатывают ферментом рестрикции DpnI для удаления нереплицированной ДНК. Затем промежуточные продукты расщепляются соответствующими ферментами рестрикции, чтобы поместить интересующий их повтор в исходную дистальную половину фрагмента ДНК длиной 3-5 кб. Промежуточные продукты репликации разделены на два перпендикулярных измерения, сначала по размеру, а затем по форме. Следуя гибридизации методом Саузерн-блот, этот подход позволяет исследователям наблюдать остановку вилки при различных структурообразующих повторах на нисходящей половине Y-дуги репликации. Кроме того, такое расположение места остановки позволяет визуализировать различные результаты остановки вилки, опосредованной повторами, такие как реверсирование вилки, появление сходящейся вилки и рекомбинационный перезапуск вилки.

Введение

Короткие тандемные повторы (STR) представляют собой небольшие, обычно 2-9 пар оснований (.о.), повторяющиеся последовательности ДНК, которые составляют около 3% генома человека^. STR играют важную роль в регуляции генов²; однако их повторяющийся состав делает их склонными к образованию неканонических вторичных структур ДНК и последующей генетической нестабильности ^3,4. От левосторонних спиралей до шпилек/крестообразных, до трех- и четырехцепочечных спиралей, эти альтернативные структуры ДНК вызывают внутренние проблемы для репсомы....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида, разработанная для нашего описанного нами анализа 2DGE в клетках млекопитающих, должна содержать источник репликации SV40 на несколько кб выше склонных к структуре повторов (рис. 2). Опережающий и запаздывающий синтез следует иметь в виду при выборе ориентации относительно происхождения повторов в плазмиду.

Рисунок 2: Расщепление плазмиды, содержащей повто....

Результаты

В случае успеха, при визуализации, можно наблюдать острую дугу репликационных вилок, простирающуюся вверх и наружу от массивного пятна 1n (рисунок 5A). Размер фрагмента, или процент репликации, определяет подвижность фрагмента в первом измерении. По мере.......

Обсуждение

2DGE обеспечивает полуколичественное и всеобъемлющее изображение относительных популяций промежуточных продуктов, возникающих при репликации той или иной последовательности. Учитывая, что хрупкие молекулярные структуры репликационных вилок должны поддерживаться ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cells	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	BP82031GAL
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-5
Ruler	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Sodium dodecyl sulfate	Millipore Sigma	436143-25G
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056