Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

Zusammenfassung

Im Folgenden wird das Verfahren zur Analyse des Replikationsverlaufs durch pathogene, strukturanfällige Wiederholungen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese skizziert.

Zusammenfassung

Die zweidimensionale Neutral/Neutral-Gelelektrophorese (2DGE) hat sich als Benchmark-Technik zur Analyse der DNA-Replikation durch natürliche Impedimente herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Progression der Replikationsgabel durch strukturanfällige, expandierbare DNA-Wiederholungen innerhalb des auf dem Affenvirus 40 (SV40) basierenden Episoms in menschlichen Zellen analysiert werden kann. Kurz gesagt, bei der Plasmidtransfektion in menschliche Zellen werden Replikationszwischenprodukte durch das modifizierte Hirt-Protokoll isoliert und mit dem DpnI-Restriktionsenzym behandelt, um nicht-replizierte DNA zu entfernen. Zwischenprodukte werden dann von geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um die Wiederholung des Interesses in der ursprungsdistalen Hälfte eines 3-5 kb langen DNA-Fragments zu platzieren. Die Replikationszwischenprodukte werden in zwei senkrechte Dimensionen unterteilt, zunächst nach Größe und dann nach Form. Nach der Southern-Blot-Hybridisierung ermöglicht dieser Ansatz den Forschern, das Abwürgen der Gabel bei verschiedenen strukturbildenden Wiederholungen in der absteigenden Hälfte des Replikations-Y-Bogens zu beobachten. Darüber hinaus ermöglicht diese Positionierung des Strömungsabrisses die Visualisierung verschiedener Ergebnisse des wiederholt vermittelten Gabelabwürgens, wie z. B. die Gabelumkehr, das Aufkommen einer konvergierenden Gabel und den rekombinatorischen Gabelneustart.

Einleitung

Short Tandem Repeats (STR) sind kleine, typischerweise 2-9 Basenpaare (bp), sich wiederholende DNA-Sequenzen, die etwa 3 % des menschlichen Genoms ausmachen¹. STR spielen eine wichtige Rolle bei der Genregulation²; ihre repetitive Zusammensetzung macht sie jedoch anfällig für die Bildung nicht-kanonischer DNA-Sekundärstrukturen und die anschließende genetische Instabilität ^3,4. Von linkshändigen Helices über Haarnadeln/Kreuzformen bis hin zu drei- und viersträngigen Helices stellen diese alternativen DNA-Strukturen intrinsische H....

Protokoll

HINWEIS: Das Plasmid, das für unsere skizzierte 2DGE-Analyse in Säugetierzellen entwickelt wurde, sollte einen SV40-Replikationsursprung mehrere kb stromaufwärts von strukturanfälligen Wiederholungen enthalten (Abbildung 2). Die führende und nachlaufende Synthese sollte bei der Wahl der Ausrichtung relativ zum Ursprung, in die die Wiederholungen in das Plasmid kloniert werden sollen, berücksichtigt werden.

Diskussion

2DGE liefert ein semiquantitatives und umfassendes Bild der relativen Populationen von Zwischenstufen, die während der Replikation einer bestimmten Sequenz entstehen. Da die fragilen molekularen Strukturen der Replikationsgabeln während dieses Verfahrens erhalten bleiben müssen, sollte große Sorgfalt walten gelassen werden, um physikalisches Scheren und chemische Denaturierung zu verhindern. Daher wird dringend empfohlen, während der Plasmidisolierung auf eine alkalische Behandlung .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cells	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	BP82031GAL
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-5
Ruler	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Sodium dodecyl sulfate	Millipore Sigma	436143-25G
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056