Analisi elettroforetica della replicazione attraverso ripetizioni di DNA a struttura inclini all'episoma umano basato su SV40

Riepilogo

Qui, descriviamo la procedura per analizzare la progressione della replicazione attraverso ripetizioni patogene e inclini alla struttura utilizzando l'elettroforesi su gel bidimensionale.

Abstract

La gel-elettroforesi bidimensionale neutra/neutra (2DGE) è emersa come tecnica di riferimento per analizzare la replicazione del DNA attraverso impedimenti naturali. Questo protocollo descrive come analizzare la progressione della forcella di replicazione attraverso ripetizioni di DNA espandibili e soggette a struttura all'interno dell'episoma basato sul virus delle scimmie 40 (SV40) nelle cellule umane. In breve, dopo la trasfezione del plasmide nelle cellule umane, gli intermedi di replicazione vengono isolati mediante il protocollo Hirt modificato e trattati con l'enzima di restrizione DpnI per rimuovere il DNA non replicato. Gli intermedi vengono quindi digeriti da appropriati enzimi di restrizione per collocare la ripetizione di interesse all'interno della metà distale di origine di un frammento di DNA lungo 3-5 kb. Gli intermedi di replicazione sono separati in due dimensioni perpendicolari, prima per dimensione e poi per forma. Dopo l'ibridazione Southern blot, questo approccio consente ai ricercatori di osservare lo stallo della forcella in varie ripetizioni di formazione della struttura sulla metà discendente dell'arco Y di replicazione. Inoltre, questo posizionamento del sito di stallo consente la visualizzazione di vari risultati dello stallo della forcella mediato dalla ripetizione, come l'inversione della forcella, l'avvento di una forcella convergente e il riavvio della forcella ricombinatrice.

Introduzione

Le brevi ripetizioni tandem (STR) sono piccole sequenze ripetitive di DNA che costituiscono circa il 3% del genoma umano¹. Gli STR svolgono un ruolo importante nella regolazione genica²; tuttavia, la loro composizione ripetitiva li rende inclini alla formazione di strutture secondarie del DNA non canoniche e alla conseguente instabilità genetica ^3,4. Dalle eliche sinistrorse alle forcine/cruciformi, alle eliche a tre e quattro filamenti, queste strutture alternative del DNA causano sfide intrinseche per il replosoma. Un prerequis....

Protocollo

NOTA: Il plasmide progettato per la nostra analisi 2DGE delineata in cellule di mammifero dovrebbe contenere un'origine di replicazione SV40 diversi kb a monte delle ripetizioni inclini alla struttura (Figura 2). La sintesi leading e lagging dovrebbe essere tenuta a mente quando si sceglie quale orientamento rispetto all'origine le ripetizioni dovrebbero essere clonate nel plasmide.

Figura 2

Discussione

2DGE fornisce un'immagine semiquantitativa e completa delle popolazioni relative di intermedi che si formano durante la replicazione di una particolare sequenza. Dato che le fragili strutture molecolari delle forcelle di replicazione devono essere mantenute durante questa procedura, è necessario prestare molta attenzione per prevenire il taglio fisico e la denaturazione chimica. Pertanto, si raccomanda vivamente di evitare qualsiasi trattamento alcalino durante l'isolamento del plasmide.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cells	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	BP82031GAL
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-5
Ruler	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Sodium dodecyl sulfate	Millipore Sigma	436143-25G
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056