Analyse électrophorétique de la réplication à travers des répétitions d’ADN à structure variable dans l’épisome humain basé sur SV40

Résumé

Ici, nous décrivons la procédure d’analyse de la progression de la réplication à travers des répétitions pathogènes et sujettes à la structure à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.

Résumé

L’électrophorèse bidimensionnelle sur gel neutre/neutre (2DGE) est apparue comme une technique de référence pour analyser la réplication de l’ADN à travers des obstacles naturels. Ce protocole décrit comment analyser la progression de la fourche de réplication à travers des répétitions d’ADN expansibles et susceptibles de structuration dans l’épisome basé sur le virus simien 40 (SV40) dans les cellules humaines. En bref, lors de la transfection du plasmide dans des cellules humaines, les intermédiaires de réplication sont isolés par le protocole Hirt modifié et traités avec l’enzyme de restriction DpnI pour éliminer l’ADN non répliqué. Les intermédiaires sont ensuite digérés par des enzymes de restriction appropriées pour placer la répétition d’intérêt dans la moitié distale d’origine d’un fragment d’ADN de 3 à 5 kb de long. Les intermédiaires de réplication sont séparés en deux dimensions perpendiculaires, d’abord par la taille, puis par la forme. Après l’hybridation par transfert de Southern, cette approche permet aux chercheurs d’observer le décrochage de la fourche à diverses répétitions structurelles sur la moitié descendante de l’arc Y de réplication. De plus, ce positionnement du site de décrochage permet de visualiser divers résultats du décrochage à médiation répétée, tels que l’inversion de la fourche, l’avènement d’une fourche convergente et le redémarrage de la fourche recombinatoire.

Introduction

Les courtes répétitions en tandem (STR) sont de petites paires de 2 à 9 paires de bases (pb), des séquences répétitives d’ADN qui constituent environ 3 % du génome humain¹. Les STR jouent un rôle important dans la régulation des gènes² ; cependant, leur composition répétitive les rend sujets à la formation d’une structure secondaire de l’ADN non canonique et à l’instabilité génétique ultérieure ^3,4. Des hélices gauches aux épingles à cheveux/cruciformes, en passant par les hélices à trois et quatre brins, ces structures d’ADN alt....

Protocole

REMARQUE : Le plasmide conçu pour notre analyse 2DGE décrite dans les cellules de mammifères doit contenir une origine SV40 de réplication plusieurs kb en amont des répétitions sujettes à la structure (Figure 2). Les synthèses en amont et en aval doivent être gardées à l’esprit lors du choix de l’orientation par rapport à l’origine des répétitions à cloner dans le plasmide.

Figure 2 <....

Discussion

2DGE fournit une image semi-quantitative et complète des populations relatives d’intermédiaires qui apparaissent lors de la réplication d’une séquence particulière. Étant donné que les structures moléculaires fragiles des fourches de réplication doivent être maintenues tout au long de cette procédure, une grande prudence doit être mise en œuvre pour éviter le cisaillement physique et la dénaturation chimique. Par conséquent, il est fortement recommandé d’éviter to.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cells	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	BP82031GAL
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-5
Ruler	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Sodium dodecyl sulfate	Millipore Sigma	436143-25G
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056