SV40 기반 인간 에피솜 내에서 구조가 형성되기 쉬운 DNA 반복을 통한 복제의 전기영동 분석

요약

여기에서는 2차원 겔 전기영동을 사용하여 병원성, 구조가 발생하기 쉬운 반복을 통한 복제 진행을 분석하는 절차를 간략하게 설명합니다.

초록

2차원 중성/중성 겔 전기영동(2DGE)은 자연적 장애를 통해 DNA 복제를 분석하기 위한 벤치마크 기법으로 부상했습니다. 이 프로토콜은 인간 세포의 유인원 바이러스 40(SV40) 기반 에피솜 내에서 구조가 발생하기 쉽고 확장 가능한 DNA 반복을 통해 복제 포크 진행을 분석하는 방법을 설명합니다. 간단히 말해서, 플라스미드가 인간 세포로 transfection되면 복제 중간체는 modified Hirt 프로토콜에 의해 분리되고 DpnI 제한 효소로 처리되어 복제되지 않은 DNA를 제거합니다. 그런 다음 중간체를 적절한 제한 효소에 의해 절단하여 3-5kb 길이의 DNA 단편의 기원 원위 절반 내에 관심 반복을 배치합니다. 복제 중간체는 두 개의 수직 차원으로 분리되는데, 처음에는 크기에 의해, 그 다음에는 모양에 따라 분리됩니다. 서던 블롯 교잡에 이어 이 접근 방식을 통해 연구자들은 복제 Y-아크의 하강 절반에서 다양한 구조 형성 반복에서 포크가 멈추는 것을 관찰할 수 있습니다. 또한, 스톨 사이트의 이러한 포지셔닝은 포크 반전, 수렴 포크의 출현 및 재조합 포크 재시작과 같은 반복 매개 포크 실속의 다양한 결과를 시각화할 수 있습니다.

서문

STR(Short Tandem Repeats)은 일반적으로 2-9개의 염기쌍(bp)으로 작으며, 인간 게놈의 약 3%를 구성하는 DNA의 반복적인 염기서열입니다¹. STR은 유전자 조절²에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 그들의 반복적인 구성은 비표준 DNA 2차 구조 형성 및 그에 따른 유전적 불안정성을 유발합니다 ^3,4. 왼손잡이 나선에서 머리핀/십자형, 3가닥 및 4가닥 나선에 이르기까지, 이러한 대체 DNA 구조는 레플리솜에 본질적인 문제를 일으킵니다. 2차 구조 형성을 위한 자연스러운 전제 조건은 DNA 풀림이며, 이는 DNA 복제의 전제 조건입니다. 이는 게놈 기능에 대한 독특한 수수께끼를 제시하는데, 이러한 구조 중 많은 부분이 복제 중에 형성되어 replisome 진행을 방해하고 궁극적으로 복제 포크 정지 ^5,6,7 또는 심한 경우 포크 붕괴 및 DNA 파손

프로토콜

참고: 포유류 세포에서 간략하게 설명한 2DGE 분석을 위해 설계된 플라스미드에는 구조가 발생하기 쉬운 반복의 업스트림에서 수 kb 떨어진 SV40 복제 기원이 포함되어야 합니다(그림 2). 선행 및 후행 synthesis는 반복이 플라스미드에 클로닝되어야 하는 origin에 상대적인 방향을 선택할 때 염두에 두어야 합니다.

그림 2: 2DGE 분석을 위한 반복 함유 플라스미드의 분해. 구조가 발생하기 쉬운 반복은 오른쪽으로 이동하는 복제 포크에서 몇 kb 다운스트림으로 표시됩니다. 고유한 커터 1과 2를 사용한 분해는 분해된 단편의 중간 지점을 넘어서는 시퀀스가 주어지면 Y-아크의 하강하는 암에 반복 시퀀스를 배치합니다. 약어: 2DGE = 2차원 중성....

토론

2DGE는 특정 염기서열의 복제 중에 발생하는 중간체의 상대적 집단에 대한 반정량적이고 포괄적인 이미지를 제공합니다. 복제 포크의 취약한 분자 구조가 이 절차 전반에 걸쳐 유지되어야 한다는 점을 감안할 때 물리적 전단 및 화학적 변성을 방지하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다. 따라서 플라스미드 분리 중에는 알칼리 처리를 피하는 것이 매우 권장됩니다. 이?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cells	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	BP82031GAL
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-5
Ruler	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Sodium dodecyl sulfate	Millipore Sigma	436143-25G
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056