Análise eletroforética da replicação por meio de repetições de DNA propensas à estrutura dentro do epissoma humano baseado em SV40

Resumo

Aqui, descrevemos o procedimento para analisar a progressão da replicação por meio de repetições patogênicas e propensas à estrutura usando eletroforese em gel bidimensional.

Resumo

A eletroforese em gel bidimensional neutra/neutra (2DGE) surgiu como uma técnica de referência para analisar a replicação do DNA por meio de impedimentos naturais. Este protocolo descreve como analisar a progressão do garfo de replicação por meio de repetições de DNA expansíveis e propensas à estrutura dentro do epissoma baseado no vírus símio 40 (SV40) em células humanas. Em resumo, após a transfecção do plasmídeo em células humanas, os intermediários de replicação são isolados pelo protocolo Hirt modificado e tratados com a enzima de restrição DpnI para remover o DNA não replicado. Os intermediários são então digeridos por enzimas de restrição apropriadas para colocar a repetição de interesse dentro da metade distal de origem de um fragmento de DNA de 3-5 kb de comprimento. Os intermediários de replicação são separados em duas dimensões perpendiculares, primeiro por tamanho e depois por forma. Após a hibridização Southern blot, essa abordagem permite que os pesquisadores observem o travamento do garfo em várias repetições de formação de estrutura na metade descendente do arco Y de replicação. Além disso, esse posicionamento do local de parada permite a visualização de vários resultados da parada do garfo mediada por repetição, como reversão do garfo, o advento de um garfo convergente e a reinicialização do garfo recombinacional.

Introdução

As repetições curtas em tandem (STR) são pequenas, normalmente de 2 a 9 pares de bases (pb), sequências repetitivas de DNA que constituem cerca de 3% do genoma humano¹. STR desempenham um papel importante na regulação gênica²; no entanto, sua composição repetitiva os deixa propensos à formação de estruturas secundárias de DNA não canônicas e subsequente instabilidade genética ^3,4. De hélices canhotas a grampos de cabelo / cruciformes, a hélices de três e quatro fitas, essas estruturas alternativas de DNA causam desafios intrínsec....

Protocolo

NOTA: O plasmídeo projetado para nossa análise 2DGE delineada em células de mamíferos deve conter uma origem de replicação SV40 vários kb a montante de repetições propensas à estrutura (Figura 2). A síntese principal e atrasada deve ser mantida em mente ao escolher a orientação em relação à origem em que as repetições devem ser clonadas no plasmídeo.

Figura 2: Digestão de plas....

Discussão

O 2DGE fornece uma imagem semiquantitativa e abrangente das populações relativas de intermediários que surgem durante a replicação de uma sequência específica. Dado que as frágeis estruturas moleculares dos garfos de replicação devem ser mantidas durante todo este procedimento, deve-se tomar muito cuidado para evitar cisalhamento físico e desnaturação química. Portanto, é altamente recomendável que qualquer tratamento alcalino seja evitado durante o isolamento do plasmíd.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cells	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	BP82031GAL
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-5
Ruler	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Sodium dodecyl sulfate	Millipore Sigma	436143-25G
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056