SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

要約

ここでは、2次元ゲル電気泳動を使用して、病原性の構造が取りやすいリピートによる複製進行を解析する手順について概説します。

要約

二次元中性/中性ゲル電気泳動(2DGE)は、自然障害を介したDNA複製を解析するためのベンチマーク技術として登場しました。このプロトコルでは、ヒト細胞内のサルウイルス40(SV40)ベースのエピソーム内で、構造が形成しやすく拡張可能なDNAリピートを介した複製フォークの進行を解析する方法について説明します。簡単に言うと、ヒト細胞へのプラスミドトランスフェクションでは、複製中間体を改良Hirtプロトコルで単離し、DpnI制限酵素で処理して非複製DNAを除去します。次に、中間体を適切な制限酵素によって消化し、目的のリピートを3〜5 kb長のDNAフラグメントの起源-遠位半分内に配置します。複製中間体は、最初にサイズによって、次に形状によって、2つの垂直な次元に分割されます。サザンブロットハイブリダイゼーションに続いて、このアプローチにより、研究者はレプリケーションY弧の下降する半分のさまざまな構造形成リピートでのフォークストールを観察することができます。さらに、このストールサイトの配置により、フォークの反転、収束フォークの出現、リコンビネーションフォークの再起動など、反復媒介フォークストールのさまざまな結果を視覚化できます。

概要

ショートタンデムリピート(STR)は小さく、通常は2〜9塩基対(bp)のDNAの反復配列で、ヒトゲノムの約3%を占めています¹。STRは遺伝子調節において重要な役割を果たします²;しかし、それらの反復的な組成は、非標準的なDNA二次構造の形成とそれに続く遺伝的不安定性を引き起こしやすい^3,4。左巻きヘリックスからヘアピン/十字形、3本鎖および4本鎖ヘリックスまで、これらの代替DNA構造はレプリソームに固有の課題を引き起こします。二次構造形成の自然な前提条件は、DNA複製の前提条件であるDNAの巻き戻しです。これは、これらの構造の多くが複製中に形成され、レプリソームの進行を妨げ、最終的に複製フォークのストール^5,6,7を引き起こし、深刻な場合にはフォークの崩壊とDNAの切断^8,9を引き起こす可能性があるため、ゲノム機能にとってユニークな難問を示しています。....

プロトコル

注:哺乳類細胞における2DGE分析のために設計されたプラスミドは、構造が起こりやすいリピートの数kb上流にSV40の複製起点を含んでいる必要があります(図2)。リード合成と遅延合成は、リピートをプラスミドにクローニングする原点に対する向きを選択する際に留意する必要があります。

図2:2DGE分析のためのリピート含有プラスミドの消化。 構造が不安定なリピートは、右に移動するレプリケーションフォークから数kb下流に描かれています。独自のカッター 1 と 2 による分解では、分解されたフラグメントの中間点を超えるシーケンスが与えられ、リピート シーケンスが Y アークの下降アームに配置されます。略語:2DGE = 二次元中性/中性ゲル電気泳動。

ディスカッション

2DGEは、特定の配列の複製中に生じる中間体の相対的な集団の半定量的かつ包括的なイメージを提供します。複製フォークの壊れやすい分子構造は、この手順全体を通して維持する必要があることを考えると、物理的なせん断と化学的変性を防ぐために細心の注意を払う必要があります。したがって、プラスミド単離中はアルカリ性処理を避けることを強くお勧めし?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Buffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Buffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T cells	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
Church and Gibert's hybriddization buffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA labeling kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, high gluctose, GltaMAX Supplement, pyruvate	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Additional restriction enzymes will need to be purchased as well
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific	BP82031GAL
Fetal Bovine Serum	VWR	97068-085
Hydrochloric acid solution, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA and siRNA Transfection Reagent with Buffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphate Buffer Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphate Buffer Saline, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-4
Pure Cellulose Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-714-5
Ruler	Fisher Scientific	09-016
Scalpel	Fisher Scientific	12-460-451
Sodium dodecyl sulfate	Millipore Sigma	436143-25G
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell Horizontal Electrophoresis System	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056