马肠胶质细胞培养及其在马肠神经炎症机制研究中的应用

摘要

肠道胶质细胞因其在肠道稳态和疾病过程（包括术后并发症）中的作用而越来越受到认可。从紧急探查剖腹手术中恢复的马患者术后炎症风险很高，这凸显了建立可重复的马肠道神经胶质原代细胞培养用于研究的重要性。

摘要

马绞痛（急腹症）的术后炎症不仅会导致客户成本增加、患者不适和住院时间增加，而且在许多情况下，事实证明会危及生命。肠道神经胶质细胞是一种独特的肠道细胞群，因其在感知胃肠道环境和与周围细胞类型交流方面的作用而日益得到认可。肠道胶质细胞和肠上皮细胞之间的相互作用可能被证明对于确定马肠道神经胶质细胞如何改变粘膜屏障以调节健康和绞痛中的炎症至关重要。

为了研究这种相互作用，我们提出了一种从马空肠建立原代马肠肠胶质细胞培养物并将培养物暴露于已知存在于绞痛中的炎症状况的方法。原代肠道神经胶质细胞培养物来自因与绞痛无关的原因而被安乐死的成年马。显微解剖肠绒毛和固有层，露出粘膜下层。分离的粘膜下层用胶原酶、蛋白酶和牛血清白蛋白进行酶消化 2-3 h。接下来，包括离心、移液和细胞过滤器 （40-100 μm） 的机械消解，得到用于在 0.05 mg/mL 聚-L-赖氨酸包被的孔上铺板的沉淀，浓度为 ~400,000 个细胞/300 μL 培养基。

汇合和第一次传代后，然后将肠胶质细胞暴露于马重组 IL-1β （0、10、25 ng） 24 小时。为了模拟绞痛时的上皮-胶质细胞相互作用，将对照或处理的肠胶质细胞调节的培养基直接添加到融合的马空肠单层中，同时使用双电极 EndOhm 室测量跨上皮电阻 （TEER）。这些数据只是马肠道神经胶质细胞培养的众多潜在有影响力应用之一。

引言

马绞痛是急诊会诊最常见的医疗主诉¹。由于高达 17% 的马匹需要手术矫正，因此提高术后结果的努力应该是马医学研究的重中之重²。目前，术后绞痛患者患多种危及生命的疾病的风险很高，包括败血症/内毒素休克（12.3% 的患者）和术后肠梗阻（13.7% 的患者）³。尽管术后并发症的治疗取得了进展，但仍需要先进的治疗方法来预防或治疗这些疾病。

最近的研究强调了绞痛患者的局部和全身炎症状态⁴。例如，促炎蛋白，如肿瘤坏死因子 （TNF） α、白细胞介素 1β （IL-1β）、白细胞介素 6 （IL-6） 和单核细胞趋化蛋白-1，都已被证明在肠绞痛粘膜中的表达显著增加于正常肠组织⁴。从系统性的角度来看，已经证明肠道组织中 TNF α 的增加与术后鼻胃管反流大于 2 L 的风险增加相关，这是术后运动障碍的一般衡量标准⁴。众所周知，白细胞介素 IL-1β 和 TNF α 的给药能够诱导感染性休克的临床症状⁵。

肠绞痛组织炎症状态及其与术后并发症....

研究方案

马肠道神经胶质原代培养物是从三匹马身上获得的，这些马因与本研究无关的原因而用过量的巴比妥酸盐人道地实施了安乐死。选择用于培养研究的马是目前没有胃肠道疾病史的成年马。

1. 马粘膜下肠道神经胶质原代培养

1. 从三匹独立的成年马获得的空肠隐窝中生长马上皮单层。
   1. 用涂层溶液在 37 °C 下包被 24 孔板 2 小时或在室温下过夜，用无菌水洗涤 2 次，并在室温下储存，直到细胞准备好进行电镀。
   2. 人道安乐死后，在 60 分钟内取出一段空肠并将其放入冰上的冷林格氏溶液中。
   3. 从空肠中取出 10 cm 的部分，并在肠系边界打开，以保持非淋巴区域位于组织中心。将部分修剪成大约 7 厘米 x 7 厘米的部分。解剖前用新鲜的林格氏液冲洗组织。
   4. 将组织固定在冷林格溶液或 PBS 粘膜面朝上的硅弹性体涂层培养皿上，尽可能拉伸组织（图 1A）。
   5. 用弯曲的镊子去除肠绒毛（图 1B），然后从大约 5 cm x 5 cm 的非淋巴区域去除固有层（图 1C）。
      注意：这些层很容易与粘膜下层分离（

讨论

本研究的目的是开发一种可重复的马粘膜下肠道胶质细胞原代培养方法，并证明其在肠绞痛时模拟上皮-胶质细胞相互作用的应用。肠道胶质细胞分离和培养在马中是新颖的，已被证明有助于了解猪和啮齿动物模型以及人类的肠道疾病途径 ^6,7,13,14。研究这种细胞群可能很重要?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution