At Enterik Glial Kültürü ve At Kolikinde Nöral İnflamatuar Mekanizmanın Çalışmasına Uygulama

Özet

Enterik glia, postoperatif komplikasyonlar da dahil olmak üzere bağırsak homeostazı ve hastalık süreçlerindeki rolleri nedeniyle giderek daha fazla tanınmaktadır. Acil keşif laparotomisinden iyileşen at hastaları, yüksek inflamatuar postoperatif durum riskinden muzdariptir ve bu da çalışma için tekrarlanabilir at enterik glial primer hücre kültürü oluşturmanın önemini vurgulamaktadır.

Özet

At kolikinin (akut karın) enflamatuar postoperatif koşulları, yalnızca müşteri maliyetinin artmasına, hasta rahatsızlığına ve hastanede kalış süresine katkıda bulunmakla kalmaz, aynı zamanda birçok durumda yaşamı tehdit edici olduğunu kanıtlar. Eşsiz bir bağırsak hücresi popülasyonu olan enterik glia, gastrointestinal ortamı algılamadaki ve çevredeki hücre tipleriyle iletişim kurmadaki rolleri nedeniyle giderek daha fazla kabul görmektedir. Enterik glia ve bağırsak epiteli arasındaki etkileşimler, at enterik gliasının sağlık ve kolikteki iltihabı modüle etmek için mukozal bariyeri nasıl değiştirebileceğini belirlemede kritik olabilir.

Bu etkileşimi incelemek için, at jejunumundan primer at enterik glial kültürleri oluşturmak ve kültürleri kolikte mevcut olduğu bilinen enflamatuar koşullara maruz bırakmak için bir yöntem sunuyoruz. Primer enterik glial kültürler, kolik ile ilgisi olmayan nedenlerle ötenazi yapılan yetişkin atlardan elde edildi. İntestinal villus ve lamina propria, submukozayı ortaya çıkarmak için mikrodiseke edildi. İzole edilen submukozaya 2-3 saat boyunca kollajenaz, proteaz ve sığır serum albümini ile enzimatik sindirim uygulandı. Daha sonra, santrifüjleme, pipetleme ve hücre süzgeçlerini (40-100 μm) içeren mekanik sindirim, ~ 400.000 hücre / 300 μL ortam konsantrasyonunda 0.05 mg / mL poli-L-lizin kaplı kuyucuklar üzerinde kaplama için kullanılan bir pelet verdi.

Birleşme ve ilk geçişi takiben, enterik glial hücreler daha sonra 24 saat boyunca at rekombinant IL-1β'ya (0, 10, 25 ng) maruz bırakıldı. Kolik zamanında epitelyal-glial etkileşimleri modellemek için, çift elektrotlu bir EndOhm odası kullanılarak transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçülürken, kontrol veya tedavi edilen enterik glia tarafından koşullandırılan ortam, doğrudan birleşik at jejunal tek katmanlarına eklendi. Bu veriler, at enterik glial kültürünün birçok potansiyel etkili uygulamasından sadece birini göstermektedir.

Giriş

At kolik, acil konsültasyon için en sık tıbbi başvuru şikayetidir¹. Bu atların %17'sine kadar cerrahi düzeltme gerektiğinden, ameliyat sonrası sonuçları artırma çabaları at tıbbi araştırmalarının ön saflarında yer almalıdır². Şu anda, postoperatif kolik hastaları, sepsis/endotoksemik şok (hastaların %12,3'ü) ve postoperatif ileus (hastaların %13,7'si) dahil olmak üzere yaşamı tehdit eden çeşitli bozukluklar için yüksek risk ^{altındadır3}. Postoperatif komplikasyonların tedavisindeki ilerlemeye rağmen, bu durumların önlenmesi veya tedavisi için ileri tedavilere ihtiy....

Protokol

At enterik glial primer kültürleri, bu çalışma ile ilgisi olmayan nedenlerle aşırı dozda barbitürat ile insanca ötenazi yapılan üç attan elde edildi. Kültür çalışmaları için seçilen atlar, mevcut gastrointestinal hastalık öyküsü olmayan yetişkin atlardı.

1. Submukozal at enterik glial primer kültür

1. Üç ayrı yetişkin at atından elde edilen jejunal kriptlerden at epitel tek katmanları yetiştirin.
   1. 24 oyuklu plakaları 37 ° C'de 2 saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kaplama solüsyonu ile kaplayın, 2 kez steril suyla yıkayın ve hücreler kaplamaya hazır olana kadar oda sıcaklığ....

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, at submukozal enterik gliasının primer kültürü için tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmek ve kolik zamanında epitelyal-glial etkileşimleri modellemek için uygulamasını göstermekti. Atta yeni olan enterik glia izolasyonu ve kültürünün, domuz ve kemirgen modellerinde ve insanlarda bağırsak hastalık yolaklarını anlamada faydalı olduğu kanıtlanmıştır 6,7,13,14.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution