At Enterik Glial Kültürü ve At Kolikinde Nöral İnflamatuar Mekanizmanın Çalışmasına Uygulama

Özet

Enterik glia, postoperatif komplikasyonlar da dahil olmak üzere bağırsak homeostazı ve hastalık süreçlerindeki rolleri nedeniyle giderek daha fazla tanınmaktadır. Acil keşif laparotomisinden iyileşen at hastaları, yüksek inflamatuar postoperatif durum riskinden muzdariptir ve bu da çalışma için tekrarlanabilir at enterik glial primer hücre kültürü oluşturmanın önemini vurgulamaktadır.

Özet

At kolikinin (akut karın) enflamatuar postoperatif koşulları, yalnızca müşteri maliyetinin artmasına, hasta rahatsızlığına ve hastanede kalış süresine katkıda bulunmakla kalmaz, aynı zamanda birçok durumda yaşamı tehdit edici olduğunu kanıtlar. Eşsiz bir bağırsak hücresi popülasyonu olan enterik glia, gastrointestinal ortamı algılamadaki ve çevredeki hücre tipleriyle iletişim kurmadaki rolleri nedeniyle giderek daha fazla kabul görmektedir. Enterik glia ve bağırsak epiteli arasındaki etkileşimler, at enterik gliasının sağlık ve kolikteki iltihabı modüle etmek için mukozal bariyeri nasıl değiştirebileceğini belirlemede kritik olabilir.

Bu etkileşimi incelemek için, at jejunumundan primer at enterik glial kültürleri oluşturmak ve kültürleri kolikte mevcut olduğu bilinen enflamatuar koşullara maruz bırakmak için bir yöntem sunuyoruz. Primer enterik glial kültürler, kolik ile ilgisi olmayan nedenlerle ötenazi yapılan yetişkin atlardan elde edildi. İntestinal villus ve lamina propria, submukozayı ortaya çıkarmak için mikrodiseke edildi. İzole edilen submukozaya 2-3 saat boyunca kollajenaz, proteaz ve sığır serum albümini ile enzimatik sindirim uygulandı. Daha sonra, santrifüjleme, pipetleme ve hücre süzgeçlerini (40-100 μm) içeren mekanik sindirim, ~ 400.000 hücre / 300 μL ortam konsantrasyonunda 0.05 mg / mL poli-L-lizin kaplı kuyucuklar üzerinde kaplama için kullanılan bir pelet verdi.

Birleşme ve ilk geçişi takiben, enterik glial hücreler daha sonra 24 saat boyunca at rekombinant IL-1β'ya (0, 10, 25 ng) maruz bırakıldı. Kolik zamanında epitelyal-glial etkileşimleri modellemek için, çift elektrotlu bir EndOhm odası kullanılarak transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçülürken, kontrol veya tedavi edilen enterik glia tarafından koşullandırılan ortam, doğrudan birleşik at jejunal tek katmanlarına eklendi. Bu veriler, at enterik glial kültürünün birçok potansiyel etkili uygulamasından sadece birini göstermektedir.

Giriş

At kolik, acil konsültasyon için en sık tıbbi başvuru şikayetidir¹. Bu atların %17'sine kadar cerrahi düzeltme gerektiğinden, ameliyat sonrası sonuçları artırma çabaları at tıbbi araştırmalarının ön saflarında yer almalıdır². Şu anda, postoperatif kolik hastaları, sepsis/endotoksemik şok (hastaların %12,3'ü) ve postoperatif ileus (hastaların %13,7'si) dahil olmak üzere yaşamı tehdit eden çeşitli bozukluklar için yüksek risk ^{altındadır3}. Postoperatif komplikasyonların tedavisindeki ilerlemeye rağmen, bu durumların önlenmesi veya tedavisi için ileri tedavilere ihtiyaç duyulmaya devam etmektedir.

Son araştırmalar kolik hastalarının lokal ve sistemik inflamatuar durumunu vurgulamıştır⁴. Örneğin, tümör nekroz faktörü (TNF) alfa, interlökin 1β (IL-1β), interlökin 6 (IL-6) ve monosit kemoatraktan protein-1 gibi proinflamatuar proteinlerin tümünün, normal bağırsak dokusuna göre kolik bağırsak mukozasında ekspresyonda önemli ölçüde arttığı gösterilmiştir⁴. Sistemik bir bakış açısından, bağırsak dokusunda artmış TNF alfa'nın, postoperatif dismotilitenin genel bir ölçümü olan 2 L'den daha büyük postoperatif nazogastrik reflü riskinin artması ile ilişkili olduğu gösterilmiştir⁴. İnterlökin IL-1β ve TNF alfa uygulamasının septik şok^5'in klinik belirtilerini indükleyebildiği de bilinmektedir.

Kolik bağırsak dokusunun enflamatuar durumu ve bunun postoperatif komplikasyonlarla bağlantısı için potansiyel bir açıklama bağırsak epitel bariyeridir. Sağlıkta, bağırsak yolunu kaplayan tek kolumnar epitel tabakasını birbirine bağlayan sıkı bağlantı kompleksleri, luminal içeriğin ve bakteri bileşenlerinin submukozal boşluğa ve kan dolaşımına ulaşmasını sınırlamak için fonksiyonel bir bariyer sağlar. Ancak ameliyat sırasında kolikle ilişkili barsak tıkanıklığı ve barsak manipülasyonu sonucu oluşan şişkinlik ve hasar, bu barsak bariyer fonksiyonunu bozabilir.

Bir bütün olarak bağırsak duvarının fonksiyonel bileşenleri açısından, enterik sinir sistemi içindeki submukozal enterik glial ağın, inflamatuar yolaklarla ilişkili postoperatif komplikasyonların patofizyolojik gelişiminde çok önemli olduğu ve spesifik bir terapötik hedef sağlayabileceği gösterilmiştir 6,7,8,9 . Enterik glia sadece tüm gastrointestinal sistem boyunca mevcut olmakla kalmaz, aynı zamanda bağırsak ortamının sensörleri olarak işlev görür, bağırsak duvarının çok sayıda hücre tipi ile sinyalleşmeyi etkiler ve bağırsak bariyerini^{doğrudan düzenler 6}. Bu nedenle, bağırsağın bu güçlü sensörlerinin yaralanma ve iltihaplanma ile aktive edileceğini ve bariyer geçirgenliğindeki değişiklikler gibi akut bir yanıt üretebileceğini varsaymak haklıdır.

Bu çalışma, at enterik glia kültürünü ve daha spesifik olarak, inflamatuar at enterik glia'nın bağırsak bariyer fonksiyonu üzerindeki rolünü tanımlayan ilk çalışmadır. Burada, at submukozal enterik gliasının birincil kültür yöntemlerini ve bunların inflamatuar IL-1β'ya maruz kalmaya yanıtlarını, IL-1β maruziyeti sonrası enterik glial ürünlerin at enterosit tek tabakalarının geçirgenliği üzerindeki etkisinin değerlendirilmesini ve at serumu uygulaması yoluyla olası blokajı sunuyoruz.

Protokol

At enterik glial primer kültürleri, bu çalışma ile ilgisi olmayan nedenlerle aşırı dozda barbitürat ile insanca ötenazi yapılan üç attan elde edildi. Kültür çalışmaları için seçilen atlar, mevcut gastrointestinal hastalık öyküsü olmayan yetişkin atlardı.

1. Submukozal at enterik glial primer kültür

1. Üç ayrı yetişkin at atından elde edilen jejunal kriptlerden at epitel tek katmanları yetiştirin.
   1. 24 oyuklu plakaları 37 ° C'de 2 saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kaplama solüsyonu ile kaplayın, 2 kez steril suyla yıkayın ve hücreler kaplamaya hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.
   2. İnsancıl ötenaziyi takiben, 60 dakika içinde jejunumun bir bölümünü çıkarın ve buz üzerinde soğuk Ringer solüsyonuna yerleştirin.
   3. Jejunumdan 10 cm'lik bir kısmı çıkarın ve lenfoid olmayan bölgeleri dokunun merkezinde tutmak için antimesenterik sınırda açın. Parçayı yaklaşık 7 cm x 7 cm'lik bir bölüme kesin. Diseksiyondan önce dokuyu taze Ringer solüsyonunda iyice durulayın.
   4. Dokuyu soğuk Ringer solüsyonunda veya PBS mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde silikon elastomer kaplı bir Petri kabına sabitleyin ve dokuyu mümkün olduğunca gerin (Şekil 1A).
   5. Yaklaşık 5 cm x 5 cm boyutlarındaki lenfoid olmayan bölgeden lamina propria tabakasını kıvrık forsepsli barsak villusları (Şekil 1B) ve ardından lamina propria tabakasını çıkarın.
      NOT: Bu tabakalar submukozadan kolayca ayrılır (Şekil 1B).
   6. Bir köşede mikrodiseksiyon makası ile serbest bırakarak bir tabaka halinde submukozayı çıkarın ve submukozayı jejunumun iç dairesel kas tabakasından soyarken doğal ayrılmayı gözlemleyin (Şekil 1D).
   7. Toplanan submukozal tabakayı 2-5 mm'lik parçalar halinde doğrayın ve 5 mL "Organo-FBS" (Tablo 1), 0.825 mg kollajenaz, 5 mg proteaz ve 20 mg sığır serum albümini içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Enzimatik sindirim için dokuyu 37 ° C'de 2-3 saat inkübe edin.
   8. İnkübasyonun ardından, enzim etkisini durdurmak için 10 mL oda sıcaklığında "Organo + FBS" ekleyin. Hücreleri dokudan ayırmak için doku karışımını 10 mL'lik bir serolojik pipetle yaklaşık 15 kat yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin.
   9. Süpernatanı atın ve hücreleri dokudan ayırmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet ile yaklaşık 15 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti 10 mL oda sıcaklığında PBS ile yeniden süspanse edin.
   10. Konik tüpü oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri dokudan ayırmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet ile yaklaşık 15 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti 10 mL oda sıcaklığında "Organo + FBS" ile yeniden süspanse edin.
   11. Hücreleri 100 μm, 70 μm ve ardından 40 μm gözenek boyutunda hücre süzgecinden seri olarak süzün.
   12. Filtrelenmiş hücreleri ve ortamı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL "Organo + FBS" içinde yeniden süspanse edin.
   13. Canlı hücreleri tanımlamak için tripan mavisi ile boyayın ve bunları bir hemositometre ile sayın.
   14. 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 300 μL'lik "Organo + FBS" içinde yaklaşık 400.000 hücreyi tohumlayın ve her oyuğa büyüme faktörleri ekleyin: N2 5 μL/kuyucuk, G5 5 μL/kuyucuk ve B27 10 μL/kuyucuk. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için 24 oyuklu plakayı %5 CO₂ içeren 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Yirmi dört saat sonra, ortamı yukarıdaki büyüme faktörleriyle "glia media" (Tablo 1) olarak değiştirin ve her 48 saatte bir değiştirin (Şekil 2).

2. İmmünofloresan sitoloji

1. Enterik glial hücreleri birincil kültürden (P0) (adım 2.1.14) %70-80 birleşime kadar büyütün ve bir kez geçirin (P1).
2. % 0.1 PBS azid uygulamasından önce 5 dakika boyunca% 4 paraformaldehit kullanarak% 0.1 birincil kültür (P0) hücrelerini kuyucuklara sabitleyin.
3. PBS azid,% 4 eşek serumu ve% 0.5 Triton-X'ten oluşan doygunluk solüsyonu hazırlayın. Hücreleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca geçirgen hale getirmek için kuyucuklara 300 μL doygunluk çözeltisi ekleyin.
4. Glial markör, glial fibriler asidik protein (GFAP) için birincil antikoru ve fibroblast markörü için birincil antikoru, alfa düz kas aktini, 4 ^°C'de gece boyunca inkübasyon için doygunluk çözeltisinde 1: 1.000 dilüsyonda ekleyin.
5. Eşek anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594 ve keçi anti-fare IgG Alexa Flour 488 için ikincil antikor eklemeden önce 2-3 saat boyunca doygunluk çözeltisinde 1:500 seyreltmede 3x'i PBS ile yıkayın.
6. Çekirdekleri 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile PBS'de 1: 1,000 seyreltmede 5 dakika boyayın.
7. PBS ile üç yıkamadan sonra, hücreleri% 0.1 PBS azid içinde saklayın.

3. Submukozal at enterik glial primer kültür IL-1β maruziyeti

1. İlk geçitten (P1) gelen hücreler %70-80 birleşmeye ulaştığında, IL-1β maruz kalma deneyini gerçekleştirin. Kuyuları 24 saat boyunca 0 ng, 10 ng ve 25 ng IL-1β'ya maruz bırakın. 24 saat sonra, her bir kuyucuğun ortamını -80 °C'de saklayın ve saklayın.

4. Enterosit tek tabakalarının üretimi için at organoid kültürü

NOT: Stewart ve ark. 2018'de yayınlanan protokol, kriyobanked edilmiş banklı at bağırsak kriptleri ve tomurcukları 2D enteroid çalışmaları için genişletildi¹⁰.

1. Transwell eki başına yaklaşık 700-1.000 tomurcuk / kript parçası (tek hücrelere ayrıldığında 40.000-50.000 hücre) kullanın. Enterositlerin eklenmesinden önce transwell eklerini 42 μL% 0.05 Matrigel ile kaplayın. 37 ^oC'de 1 saat inkübe ederek Matrigel'in ek parçaya sabitlenmesine izin verin Ekstra ortamı aspire edin ve transwell'lerin üstü açık olarak 30 dakika kurumasını bekleyin. Her bir transwell ekine 200 μL DMEM-F12 ortamı ekleyin ve plakayı kullanana kadar 37 °C'de saklayın.
2. Organoidleri içeren Matrigel köftelerini PBS ile yıkayın ve ardından buz üzerindeyken 500 μL Hücre Geri Kazanımına maruz bırakın. Hücrelerin 15 mL'lik bir tüpe tam olarak toplanmasını sağlamak için bunları tekrar tekrar pipetleyin.
3. Tüpü 300 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini bağırsak epitel kök hücre (IESC) ortamının hedef hacminde askıya alın. İstenilen tek katman sayısını 200 μL ortamla çarparak hedef hacmi hesaplayın. (Tablo 1).
4. 1 mL'lik bir şırıngayı IESC ortamında önceden kaplayın ve hücre süspansiyonunu 16 G'lik bir iğne ile aspire edin. 16 G'lik iğneyi 28 G'lik bir iğne ile değiştirin ve organoidlerin ayrılmasını teşvik etmek için hücre süspansiyonunu içinden çıkarın.
5. Elde edilen hücre süspansiyonunun 200 μL'sini kaplanmış transwell'lerin apikal tarafına ve 500 μL IESC'yi ve ayrıca transwell insert'in¹⁰ bazal tarafına daha önce tarif edilen büyüme faktörlerini yerleştirin. Birleşme noktasına ulaşılana kadar ortamı ve büyüme faktörlerini her 24-48 saatte bir değiştirin. Birleşmeyi, 1.000 ohmsxcm'lik bir TEER'ye karşılık gelen hücre yoğunluğu olarak tanımlayın ^2,11. Ölçüm için adım 5.1'e bakın.

5. İnflamatuar sitokinlere ve at enterik glial ürünlerine maruz kaldıktan sonra at enterosit tek tabaka geçirgenliği

1. Tek katmanlar boyunca TEER'i ölçmek için çift elektrotlu bir TEER ölçüm odası kullanın ve her bir transwell geçirgen membran boyunca bir baz okuması oluşturun. Ölçüm yapmadan önce IESC ortamının ve transwell'in oda sıcaklığına gelmesi için 15 dakika olduğundan emin olun. Kültür kabını 1,5 mL IESC ortamı ile doldurun ve ölçüm sırasında sıvı çizgilerinin eşleşmesi için transwell ekinde tam olarak 200 μL ortam bulunduğundan emin olun.
2. Transwell eklerinin bazolateral yönünü, kuyucuk başına 25 ng IL-1β, 10 ng ve 25 ng interlökin 6 (IL-6) inflamatuar sitokinlere veya 10 ng veya 25 ng IL-1β'ya maruz kalan kültürlerin glial ürünlerine maruz bırakın. Kontrol transwell eklerinin bazolateral yönünü glia ortamına ve IL-1β'ya maruz kalmayan kültürlerden glia ortamına maruz bırakın.
3. TEER'i 10-15 dakikalık aralıklarla 45 dakika boyunca ölçün ve her bir transwell'i kültür kabına yerleştirin.

6. İstatistik

1. 0, 10, 20, 30 ve 45 dakika zaman noktaları için her bir transwell'in TEER'inin kat değişimini hesaplayın.
2. Tercih edilen yazılımı kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız), azalmış TEER ile IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng ve 100 ng) ve glia ortamına (0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β ve 25 ng IL-1β'ya maruz kalan) bazolateral maruziyet arasındaki korelasyonları karşılaştırın.

Sonuçlar

Daha fazla enzimatik ve mekanik sindirim ile at jejunumunun submukozal tabakaya (Şekil 1) mikrodiseksiyonu, at enterik gliasının canlı hücre kültürlerini üretebilir. Hücreler, diğer türlerin enterik glia'sı ile tutarlı iğ şeklindeki hücrelerin baskınlığı ile bir pleomorfizm gösterdi (Şekil 2A). Kültürler, düşük fibroblast kontaminasyonu ile seçici glial markör, glial fibriler asidik protein (GFAP) i?...

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, at submukozal enterik gliasının primer kültürü için tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmek ve kolik zamanında epitelyal-glial etkileşimleri modellemek için uygulamasını göstermekti. Atta yeni olan enterik glia izolasyonu ve kültürünün, domuz ve kemirgen modellerinde ve insanlarda bağırsak hastalık yolaklarını anlamada faydalı olduğu kanıtlanmıştır 6,7,13,14.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution