Culture gliale entérique équine et application à l’étude d’un mécanisme inflammatoire neuronal dans les coliques équines

Résumé

Les cellules gliales entériques sont de plus en plus reconnues pour leur rôle dans l’homéostasie intestinale et les processus pathologiques, y compris les complications postopératoires. Les patients équins qui se remettent d’une laparotomie exploratoire d’urgence présentent un risque élevé de conditions postopératoires inflammatoires, ce qui souligne l’importance d’établir une culture de cellules primaires gliales entériques entériques équines reproductibles pour l’étude.

Résumé

Les affections postopératoires inflammatoires de la colique équine (abdomen aigu) contribuent non seulement à l’augmentation des coûts pour les clients, à l’inconfort du patient et à la durée d’hospitalisation, mais dans de nombreux cas, elles mettent la vie en danger. Une population unique de cellules intestinales, les cellules gliales entériques, est de plus en plus reconnue pour son rôle dans la détection de l’environnement gastro-intestinal et la communication avec les types de cellules environnantes. Les interactions entre la glie entérique et l’épithélium intestinal peuvent s’avérer essentielles pour établir comment la glie entérique équine peut modifier la barrière muqueuse pour moduler l’inflammation en santé et les coliques.

Pour étudier cette interaction, nous présentons une méthode d’établissement de cultures gliales entériques équines primaires à partir de jéjunum équin et d’exposition des cultures à des conditions inflammatoires connues pour être présentes dans les coliques. Des cultures gliales entériques primaires ont été obtenues à partir de chevaux adultes euthanasiés pour des raisons non liées aux coliques. Les villosités intestinales et la lamina propria ont été micro-disséquées pour exposer la sous-muqueuse. La sous-muqueuse isolée a subi une digestion enzymatique avec de la collagénase, de la protéase et de l’albumine sérique bovine pendant 2 à 3 heures. Ensuite, la digestion mécanique impliquant la centrifugation, le pipetage et les crépines cellulaires (40-100 μm) a permis d’obtenir une pastille utilisée pour le placage sur des puits recouverts de poly-L-lysine à 0,05 mg/mL à une concentration de ~400 000 cellules/300 μL de milieu.

Après la confluence et le premier passage, les cellules gliales entériques ont ensuite été exposées à l’IL-1β recombinante équine (0, 10, 25 ng) pendant 24 h. Pour modéliser les interactions épithéliales-gliales au moment de la colique, un milieu conditionné par une glie entérique témoin ou traitée a été ajouté directement à des monocouches jéjunales équines confluentes tout en mesurant la résistance électrique transépithéliale (TEER) à l’aide d’une chambre EndOhm à double électrode. Ces données ne sont qu’une des nombreuses applications potentielles de la culture gliale entérique équine.

Introduction

La colique équine est la plainte médicale la plus répandue pour une consultation d’urgence¹. Avec jusqu’à 17 % de ces chevaux nécessitant une correction chirurgicale, les efforts visant à augmenter les résultats postopératoires devraient être à l’avant-garde de la recherche médicale équine². Actuellement, les patients souffrant de coliques postopératoires présentent un risque élevé de plusieurs troubles potentiellement mortels, notamment une septicémie/choc endotoxémique (12,3 % des patients) et un iléus postopératoire (13,7 % des patients)³. Malgré les progrès réalisés dans le traitement des complications postopératoires, il existe toujours un besoin de traitements avancés pour prévenir ou traiter ces affections.

Des recherches récentes ont mis en évidence l’état inflammatoire local et systémique des patients souffrant de coliques⁴. Par exemple, il a été démontré que l’expression des protéines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale (TNF) alpha, l’interleukine 1β (IL-1β), l’interleukine 6 (IL-6) et la protéine chimioattractante monocytaire-1 est significativement augmentée dans la muqueuse intestinale colique par rapport au tissu intestinal normal⁴. D’un point de vue systémique, il a été démontré que l’augmentation du TNF alpha dans le tissu intestinal est corrélée à une augmentation du risque de reflux nasogastrique postopératoire supérieur à 2 L, une mesure générale de la dysmotilité postopératoire⁴. On sait également que l’administration d’interleukine, d’IL-1β et de TNF alpha est capable d’induire des signes cliniques de choc septique⁵.

Une explication potentielle de l’état inflammatoire du tissu intestinal colique et de son lien avec les complications postopératoires est la barrière épithéliale intestinale. En santé, les complexes de jonctions serrées reliant la couche unique d’épithélium cylindrique qui tapisse le tractus intestinal fournissent une barrière fonctionnelle pour limiter le contenu luminal et ses composants bactériens à atteindre l’espace sous-muqueux et la circulation sanguine. Cependant, la distension et les dommages causés par l’obstruction intestinale associée aux coliques et la manipulation intestinale pendant la chirurgie peuvent perturber cette fonction de barrière intestinale.

En ce qui concerne les composants fonctionnels de la paroi intestinale dans son ensemble, il a été démontré que le réseau glial entérique sous-muqueux au sein du système nerveux entérique est crucial dans le développement physiopathologique des complications postopératoires associées aux voies inflammatoires et peut fournir une cible thérapeutique spécifique 6,7,8,9 . Non seulement les cellules gliales entériques sont présentes dans tout le tractus gastro-intestinal, mais elles agissent comme des capteurs de l’environnement intestinal, influencent la signalisation avec de nombreux types de cellules de la paroi intestinale et régulent directement la barrière intestinale⁶. Il est donc justifié de supposer que ces puissants capteurs de l’intestin seraient activés par une blessure et une inflammation et pourraient produire une réponse aiguë telle que des altérations de la perméabilité de la barrière.

Cette étude est la première à décrire la culture de la glie entérique équine et, plus précisément, le rôle de la glie entérique enchérie équine inflammatoire sur la fonction de barrière intestinale. Ici, nous présentons des méthodes de culture primaire de cellules gliales entériques sous-muqueuses équines et leur réponse à l’exposition à l’IL-1β inflammatoire, l’évaluation de l’effet des produits gliaux entériques après exposition à l’IL-1β sur la perméabilité des monocouches d’entérocytes équins, et un blocage possible par l’application de sérum équin.

Protocole

Des cultures primaires de cellules gliales entériques équines ont été obtenues à partir de trois chevaux euthanasiés sans cruauté avec une surdose de barbiturique pour des raisons sans rapport avec cette étude. Les chevaux sélectionnés pour les études de culture étaient des chevaux adultes sans antécédents actuels de maladie gastro-intestinale.

1. Culture primaire gliale entérique équine sous-muqueuse

1. Cultivez des monocouches épithéliales équines à partir de cryptes jéjunales obtenues à partir de trois chevaux équins adultes distincts.
   1. Enduire les plaques à 24 puits d’une solution d’enrobage pendant 2 h à 37 °C ou toute la nuit à température ambiante, les laver 2 fois à l’eau stérile et les conserver à température ambiante jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour le placage.
   2. Après l’euthanasie sans cruauté, dans les 60 minutes, retirez une section du jéjunum et placez-la dans une solution froide de Ringer sur de la glace.
   3. Retirez une portion de 10 cm du jéjunum et ouvrez-la au niveau de la bordure antitimerentique pour maintenir les régions non lymphoïdes au centre du tissu. Coupez la portion en une section d’environ 7 cm x 7 cm. Rincez bien le tissu dans une solution fraîche de Ringer avant la dissection.
   4. Fixez le tissu sur une boîte de Pétri recouverte d’élastomère de silicone dans une solution de Ringer froide ou côté muqueuse PBS vers le haut, en étirant le tissu autant que possible (Figure 1A).
   5. Retirer les villosités intestinales à l’aide d’une pince incurvée (figure 1B) puis la couche de lamina propria de la région non lymphoïde d’environ 5 cm x 5 cm (figure 1C).
      REMARQUE : Ces couches se séparent facilement de la sous-muqueuse (Figure 1B).
   6. Retirez la sous-muqueuse en une seule feuille en la libérant avec des ciseaux de microdissection dans un coin et observez la séparation naturelle tout en décollant la sous-muqueuse de la couche musculaire circulaire interne du jéjunum (Figure 1D).
   7. Émincez la couche sous-muqueuse recueillie en morceaux de 2 à 5 mm et placez-les dans un tube conique de 50 ml contenant 5 ml d'« Organo-FBS » (tableau 1), 0,825 mg de collagénase, 5 mg de protéase et 20 mg d’albumine sérique bovine. Incuber le tissu pendant 2-3 h à 37 °C pour une digestion enzymatique.
   8. Après l’incubation, ajouter 10 mL d'« Organo + FBS » à température ambiante pour arrêter l’action enzymatique. Pipeter le mélange tissulaire de haut en bas environ 15 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml pour dissocier les cellules du tissu, puis centrifuger à 3 000 × g pendant 3 minutes à température ambiante.
   9. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension avec 10 mL de PBS à température ambiante en pipetant de haut en bas environ 15 fois avec une pipette sérologique de 10 mL pour dissocier les cellules du tissu.
   10. Centrifugez le tube conique à 3 000 × g pendant 3 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension avec 10 mL d'« Organo + FBS » à température ambiante en pipetant de haut en bas environ 15x avec une pipette sérologique de 10 mL pour dissocier les cellules du tissu.
   11. Filtrez les cellules en série à travers une crépine de 100 μm, une de 70 μm, puis une crépine de 40 μm de la taille d’un pore.
   12. Centrifuger les cellules et les médias filtrés à 3 000 × g pendant 3 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL d'« Organo + FBS ».
   13. Colorer au bleu trypan pour identifier les cellules vivantes et les compter à l’aide d’un hémocytomètre.
   14. Ensemencez environ 400 000 cellules dans 300 μL d'« Organo + FBS » dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et ajoutez des facteurs de croissance à chaque puits : N2 5 μL/puits, G5 5 μL/puits et B27 10 μL/puits. Placez la plaque à 24 puits dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pour permettre aux cellules d’adhérer. Vingt-quatre heures plus tard, changez le milieu en « glia media » (tableau 1) avec les facteurs de croissance ci-dessus et changez toutes les 48 heures (figure 2).

2. Cytologie immunofluorescente

1. Cultivez les cellules gliales entériques de la culture primaire (P0) (étape 2.1.14) jusqu’à 70-80 % de confluence et faites-les passer une fois (P1).
2. Fixer les cellules de culture primaire (P0) dans les puits à l’aide de paraformaldéhyde à 4 % pendant 5 minutes avant l’application d’azoture de PBS à 0,1 %.
3. Préparez une solution saturante composée d’azoture PBS, de 4 % de sérum d’ânesse et de 0,5 % de Triton-X. Ajouter 300 μL de solution saturante dans les puits pour perméabiliser les cellules pendant 2 h à température ambiante.
4. Ajouter l’anticorps primaire du marqueur glial, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), et l’anticorps primaire du marqueur fibroblaste, l’actine alpha du muscle lisse alpha, à des dilutions de 1:1 000 dans une solution de saturation pour une incubation nocturne à 4 ^°C.
5. Laver 3 fois avec du PBS avant d’ajouter l’anticorps secondaire pour l’IgG anti-lapin Alexa Fluor 594 et la farine IgG Alexa 488 anti-souris pour chèvre à une dilution de 1:500 dans une solution de saturation pendant 2-3 h.
6. Tamiser les noyaux avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à une dilution de 1:1 000 dans du PBS pendant 5 min.
7. Après trois lavages avec du PBS, stockez les cellules dans de l’azoture de PBS à 0,1 %.

3. Exposition à l’IL-1β de la culture gliale entérique entérique sous-muqueuse équine

1. Lorsque les cellules du premier passage (P1) atteignent une confluence de 70 à 80 %, effectuez l’expérience d’exposition à l’IL-1β. Exposez les puits à 0 ng, 10 ng et 25 ng d’IL-1β pendant 24 h. Après 24 h, mettre en banque et stocker le milieu de chaque puits à -80 °C.

4. Culture d’organoïdes équins pour la production de monocouches d’entérocytes

REMARQUE : Conformément au protocole de Stewart et al. publié en 2018, les cryptes intestinales équines et les bourgeons cryomis en banque ont été élargis pour des études entéroïdes 2D¹⁰.

1. Utilisez environ 700 à 1 000 bourgeons/fragments de crypte (40 000 à 50 000 cellules dissociées en cellules uniques) par insert de transwell. Enduire les inserts transwell de 42 μL de Matrigel à 0,05 % avant l’ajout des entérocytes. Laissez le Matrigel être fixé sur l’insert en l’incubant pendant 1 h à 37 ^°C. Aspirez le milieu supplémentaire et laissez sécher les puits de transfusion pendant 30 min à découvert. Ajouter 200 μL de milieu DMEM-F12 dans chaque insert de puits de transwell et stocker la plaque à 37 °C jusqu’à l’utilisation.
2. Lavez les galettes Matrigel contenant les organoïdes avec du PBS, puis exposez-les à 500 μL de récupération cellulaire sur de la glace. Pipetez-les à plusieurs reprises pour assurer la collecte complète des cellules dans un tube de 15 ml.
3. Centrifuger le tube à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant et suspendre la pastille cellulaire dans le volume cible de milieu de cellules souches épithéliales intestinales (IESC). Calculez le volume cible en multipliant le nombre souhaité de monocouches par 200 μL de fluide. (Tableau 1).
4. Pré-enduire une seringue de 1 mL d’un milieu IESC et aspirer la suspension cellulaire à l’aide d’une aiguille de 16 G. Remplacez l’aiguille de 16 G par une aiguille de 28 G et éjectez la suspension cellulaire à travers celle-ci pour favoriser la séparation des organoïdes.
5. Placez 200 μL de la suspension cellulaire résultante dans la face apicale des transpuits enrobés et 500 μL d’IESC ainsi que les facteurs de croissance décrits précédemment sur la face basale de l’insert¹⁰ du transwell. Changez le milieu et les facteurs de croissance toutes les 24 à 48 h jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Définissez la confluence comme la densité cellulaire correspondant à un TEER de 1 000 ohmsxcm ^2,11. Pour la mesure, voir l’étape 5.1.

5. Perméabilité monocouche des entérocytes équins suite à une exposition à des cytokines inflammatoires et à des produits gliaux entériques équins

1. Utilisez une chambre de mesure TEER à double électrode pour quantifier le TEER à travers les monocouches et établir une lecture de base à travers chaque membrane perméable au transwell. Assurez-vous que le fluide IESC et le transwell ont 15 minutes pour revenir à température ambiante avant de prendre les mesures. Remplissez le gobelet de culture avec 1,5 ml de milieu IESC et assurez-vous qu’exactement 200 μL de milieu sont présents dans l’insert de transpuits afin que les conduites de fluide correspondent au moment de la mesure.
2. Exposer la face basolatérale des inserts du transpuits soit à des cytokines inflammatoires de 25 ng d’IL-1β, 10 ng et 25 ng d’interleukine 6 (IL-6) par puits, soit à des produits gliaux de cultures exposées à 10 ng ou 25 ng d’IL-1β. Exposer la face basolatérale des inserts du transwell témoin à la glie moyenne et à la glie médiane de cultures non exposées à l’IL-1β.
3. Mesurer la TEER pendant 45 minutes à des intervalles de 10 à 15 minutes en plaçant chaque transwell dans le godet de culture.

6. Statistiques

1. Calculez le changement de pli du TEER de chaque transwell pour les points temporels : 0, 10, 20, 30 et 45 min.
2. À l’aide du logiciel de votre choix (voir le tableau des matériaux), comparez les corrélations entre la diminution de la TEER et l’exposition basolatérale à l’IL-1β (25 ng), à l’IL-6 (10 ng, 25 ng et 100 ng) et aux milieux gliaux (exposés à 0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β et 25 ng IL-1β) pour contrôler les milieux à l’aide d’un test t unilatéral non apparié.

Résultats

La microdissection du jéjunum équin à la couche sous-muqueuse (Figure 1) avec une digestion enzymatique et mécanique supplémentaire, pourrait produire des cultures cellulaires viables de glie entérique équine. Les cellules ont montré un pléomorphisme avec une dominance de cellules en forme de fuseau compatible avec la glie entérique d’autres espèces (Figure 2A). Les cultures étaient positives pour le marqueur glial...

Discussion

Le but de cette étude était de développer une méthode reproductible de culture primaire de cellules gliales entricielles sous-muqueuses équines et de démontrer son application pour modéliser les interactions épithéliales-gliales au moment des coliques. L’isolement et la culture de la glie entérique, qui sont nouveaux chez le cheval, se sont avérés bénéfiques pour comprendre les voies des maladies intestinales chez les porcs et les rongeurs et chez les humains

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution