תרבית גליה אנטרית סוסים ויישום לחקר מנגנון דלקתי עצבי בקוליק סוסים

Summary

גליה אנטרית הופכים מוכרים יותר ויותר על תפקידם בהומאוסטזיס מעיים ובתהליכי מחלה, כולל סיבוכים לאחר הניתוח. חולי סוסים המתאוששים מלפרוטומיה גישושית חירום סובלים מסיכון גבוה למצבים דלקתיים לאחר הניתוח, מה שמדגיש את החשיבות של הקמת תרבית תאים ראשונית של גליה אנטרית סוסים חוזרת למחקר.

Abstract

מצבים דלקתיים לאחר הניתוח של קוליק סוסים (בטן חריפה) תורמים לא רק לעלות מוגברת ללקוח, אי נוחות למטופל וזמן אשפוז, אלא במקרים רבים, מתגלים כמסכני חיים. אוכלוסייה ייחודית של תאי מעי, גליה אנטרית, מוכרת יותר ויותר בזכות תפקידם בחישה של סביבת מערכת העיכול ובתקשורת עם סוגי התאים הסובבים אותה. אינטראקציות בין גליה אנטרית ואפיתל מעיים עשויות להיות קריטיות בקביעת האופן שבו גליה אנטרית של סוסים יכולה לשנות את מחסום הרירית כדי לווסת דלקת בבריאות ובקוליק.

כדי לחקור אינטראקציה זו, אנו מציגים שיטה לביסוס תרביות גליה אנטרי ראשוניות של סוסים מג'ג'ונום סוסים וחשיפת התרבויות למצבים דלקתיים הידועים כקיימים בקוליק. תרביות גליה אנטריות ראשוניות התקבלו מסוסים בוגרים שהומתו מסיבות שאינן קשורות לקוליק. וילי מעיים ולמינה פרופריה נותחו במיקרו כדי לחשוף את התת-רירית. התת-רירית המבודדת עברה עיכול אנזימטי עם קולגן, פרוטאז ואלבומין בסרום בקר במשך 2-3 שעות. לאחר מכן, עיכול מכני שכלל צנטריפוגה, פיפטינג ומסננות תאים (40-100 מיקרומטר), הניב גלולה ששימשה לציפוי על בארות מצופות פולי-L-ליזין בריכוז של ~400,000 תאים / 300 מיקרוליטר מדיה.

לאחר המפגש והמעבר הראשון, תאי הגליה האנטרית נחשפו לרקומביננטי של סוסים IL-1β (0, 10, 25 ננוגרם) במשך 24 שעות. כדי למדל אינטראקציות אפיתל-גליה בזמן קוליק, תווך המותנה על ידי בקרה או טיפול בגליה אנטרית נוסף ישירות למונושכבות ג'ג'ונל של סוסים משולבים תוך מדידת התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) באמצעות תא EndOhm בעל אלקטרודה כפולה. נתונים אלה מדגימים רק אחד מיישומים פוטנציאליים רבים בעלי השפעה של תרבית גליה אנטרית של סוסים.

Introduction

קוליק סוסים הוא התלונה הרפואית הנפוצה ביותר לייעוץ חירום¹. כאשר עד 17% מהסוסים הללו זקוקים לתיקון כירורגי, המאמצים להגדיל את התוצאות לאחר הניתוח צריכים להיות בחזית המחקר הרפואי של סוסים². כיום, חולי קוליק לאחר הניתוח חווים סיכון גבוה למספר הפרעות מסכנות חיים, כולל אלח דם/הלם אנדוטוקסמי (12.3% מהחולים) ואילאוס לאחר הניתוח (13.7% מהחולים)³. למרות התקדמות הטיפול בסיבוכים לאחר הניתוח, עדיין יש צורך בטיפולים מתקדמים למניעה או לטיפול במצבים אלה.

מחקרים אחרונים הדגישו את המצב הדלקתי המקומי והמערכתי של חולי קוליק⁴. לדוגמה, חלבונים מעודדי דלקת כגון גורם נמק הגידול (TNF) אלפא, אינטרלוקין 1β (IL-1β), אינטרלוקין 6 (IL-6) וחלבון כימואטרקנט-1 מונוציטים, הוכחו כולם כבעלי ביטוי מוגבר באופן משמעותי ברירית המעי לעומת רקמת מעי רגילה⁴. מנקודת מבט מערכתית, הוכח כי עלייה TNF אלפא ברקמת המעי מתואמת עם סיכון מוגבר של ריפלוקס nasogastric לאחר הניתוח גדול מ 2 L, מדידה כללית של dysmotility לאחר הניתוח⁴. זה ידוע גם כי הממשל של interleukin IL-1β ו TNF אלפא מסוגל לגרום סימנים קליניים של הלם ספיגה⁵.

הסבר אפשרי למצב הדלקתי של רקמת המעי הקוליק ולקשר שלו לסיבוכים לאחר הניתוח הוא מחסום האפיתל של המעי. בבריאות, מתחמי הצמתים הצפופים המקשרים בין השכבה היחידה של אפיתל העמודים המרפד את מערכת העיכול מספקים מחסום פונקציונלי המגביל את תכולת הלומינל ומרכיביו החיידקיים מלהגיע לחלל התת-רירית ולזרם הדם. עם זאת, התנפחות ונזק הנגרמים על ידי חסימת מעיים הקשורים לקוליק ומניפולציה במעיים במהלך הניתוח עלולים לשבש את תפקוד מחסום המעי הזה.

במונחים של המרכיבים הפונקציונליים של דופן המעי בכללותה, רשת הגליה האנטרית התת-רירית בתוך מערכת העצבים האנטרית הוכחה כחיונית בהתפתחות הפתופיזיולוגית של סיבוכים לאחר הניתוח הקשורים למסלולים דלקתיים ועשויה לספק יעד טיפולי ספציפי 6,7,8,9 . לא רק גליה אנטרית נוכחים בכל מערכת העיכול, אבל הם פועלים כמו חיישנים של סביבת המעי, להשפיע על איתות עם סוגים רבים של תאים של דופן המעי, ישירות לווסת את מחסום המעי⁶. לכן, מוצדק להניח כי חיישנים חזקים אלה של המעי יופעלו על ידי פציעה ודלקת ויכולים לייצר תגובה חריפה כגון שינויים בחדירות המחסום.

מחקר זה הוא הראשון לתאר את התרבות של גליה אנטרית סוסים, ובאופן ספציפי יותר, את התפקיד של גליה אנטרית סוסים דלקתית על תפקוד מחסום המעי. כאן, אנו מציגים שיטות של תרבית ראשונית של גליה אנטרית תת-רירית של סוסים ותגובתם לחשיפה ל- IL-1β דלקתי, הערכת ההשפעה של מוצרי גליה אנטריים לאחר חשיפה ל- IL-1β על החדירות של חד-שכבות אנטרוציט סוסים, ומצור אפשרי באמצעות יישום סרום סוסים.

Protocol

תרביות ראשוניות של גליה אנטרית של סוסים התקבלו משלושה סוסים שעברו המתת חסד אנושית עם מנת יתר של ברביטוראט מסיבות שאינן קשורות למחקר זה. הסוסים שנבחרו ללימודי התרבות היו סוסים בוגרים ללא היסטוריה עדכנית של מחלות במערכת העיכול.

1. סוסים תת-ריריים תרבות ראשונית של גליה אנטרית

1. לגדל monolayers אפיתל סוסים מ crypts jejunal המתקבלים משלושה סוסי סוסים בוגרים נפרדים.
   1. מצפים צלחות 24 בארות בתמיסת ציפוי למשך שעתיים ב-37°C או לילה בטמפרטורת החדר, שוטפים אותן 2x במים סטריליים ומאחסנים אותן בטמפרטורת החדר עד שהתאים מוכנים לציפוי.
   2. לאחר המתת חסד הומנית, תוך 60 דקות, הסירו חלק מהג'ג'ונום והניחו אותו בתמיסה קרה של רינגר על קרח.
   3. הסר חלק של 10 ס"מ מהג'ג'ונום ופתח אותו בגבול האנטיאנטרי כדי לשמור על אזורים שאינם לימפואידים במרכז הרקמה. חותכים את החלק לחתך בגודל של כ-7X7 ס"מ. יש לשטוף היטב את הרקמה בתמיסה טרייה של רינגר לפני הנתיחה.
   4. נעצו את הרקמה על צלחת פטרי מצופה אלסטומר סיליקון בתמיסת רינגר קרה או בצד הרירית PBS כלפי מעלה, ומתחו את הרקמה ככל האפשר (איור 1A).
   5. הסירו את וילי המעי בעזרת מלקחיים מעוקלים (איור 1B), ולאחר מכן את שכבת הלמינה פרופריה (lamina propria) מהאזור הלא-לימפואידי בגודל של כ-5X5 ס"מ (איור 1C).
      הערה: השכבות האלה נפרדות בקלות מהתת-רירית (איור 1B).
   6. הסירו את התת-רירית ביריעה אחת על-ידי שחרורה עם מספריים מיקרודיסקציה בפינה אחת, והתבוננו בהפרדה הטבעית תוך כדי קילוף התת-רירית הרחק משכבת השריר המעגלית הפנימית של הג'ג'ונום (איור 1D).
   7. טחנו את השכבה התת רירית שנאספה לחתיכות של 2-5 מ"מ והכניסו אותן לצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של "אורגנו-FBS" (טבלה 1), 0.825 מ"ג קולגן, 5 מ"ג פרוטאז ו-20 מ"ג אלבומין בסרום בקר. לדגור על הרקמה במשך 2-3 שעות ב 37 ° C לעיכול אנזימטי.
   8. לאחר הדגירה, להוסיף 10 מ"ל של טמפרטורת החדר "אורגנו + FBS" כדי לעצור את פעולת האנזים. פיפטה תערובת הרקמה למעלה ולמטה בערך 15x עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל כדי לנתק תאים מהרקמה ולאחר מכן צנטריפוגה ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   9. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה עם PBS בטמפרטורת החדר של 10 מ"ל על ידי פיפטציה מעלה ומטה שוב בערך פי 15 עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי לנתק תאים מהרקמה.
   10. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 10 מ"ל של טמפרטורת החדר "אורגנו + FBS" על ידי פיפטציה למעלה ולמטה בערך פי 15 עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי לנתק תאים מהרקמה.
   11. סנן את התאים באופן סדרתי דרך 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר, ולאחר מכן מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר בגודל נקבוביות.
   12. צנטריפוגה את התאים והמדיה המסוננים ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב -1 מ"ל של "אורגנו + FBS".
   13. כתם עם כחול טריפאן כדי לזהות תאים חיים ולספור אותם עם המוציטומטר.
   14. זרעו כ-400,000 תאים ב-300 מיקרוליטר של "אורגנו + FBS" בכל באר של צלחת בת 24 בארות והוסיפו גורמי גדילה לכל באר: N2 5 μL/well, G5 5 μL/well, ו-B27 10 μL/well. הניחו את צלחת 24 הבארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ כדי לאפשר לתאים להידבק. עשרים וארבע שעות לאחר מכן, שנו את המדיה ל"גליה מדיה" (טבלה 1) עם גורמי הגדילה לעיל ושנו כל 48 שעות (איור 2).

2. ציטולוגיה אימונופלואורסצנטית

1. לגדל את תאי הגליה האנטרית מהתרבית הראשונית (P0) (שלב 2.1.14) למפגש של 70-80% ולעבור אותם פעם אחת (P1).
2. תקן את תאי התרבית הראשונית (P0) בבארות באמצעות 4% paraformaldehyde במשך 5 דקות לפני היישום של 0.1% PBS azide.
3. הכינו תמיסת רוויה המורכבת מ-PBS azide, 4% נסיוב חמורים ו-0.5% Triton-X. הוסף 300 μL של תמיסת רוויה לבארות כדי לחלחל את התאים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף את הנוגדן העיקרי לסמן גלייה, חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), ואת הנוגדן העיקרי לסמן הפיברובלסט, אקטין שריר חלק אלפא, בדילול 1:1,000 בתמיסת רוויה לדגירת לילה ב 4 ^מעלותצלזיוס.
5. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS לפני הוספת נוגדן משני לחמור נגד ארנב IgG Alexa Fluor 594 ונגד עכבר עיזים IgG Alexa Flour 488 בדילול 1:500 בתמיסת רוויה למשך 2-3 שעות.
6. הכתימו את הגרעינים עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בדילול של 1:1,000 ב-PBS למשך 5 דקות.
7. לאחר שלוש שטיפות עם PBS, אחסנו את התאים ב-0.1% PBS azide.

3. סוסים תת-ריריים בתרבית ראשונית גליה אנטרית IL-1β חשיפה

1. כאשר תאים מהמעבר הראשון (P1) מגיעים למפגש של 70-80%, בצעו את ניסוי החשיפה IL-1β. חשוף את הבארות ל- 0 ננוגרם, 10 ננוגרם ו- 25 ננוגרם של IL-1β למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, בנק ואחסן את המדיה מכל באר ב -80 ° C.

4. תרבות אורגנואידים סוסים לייצור monolayers enterocyte

הערה: בעקבות פרוטוקול Stewart et al. שפורסם בשנת 2018, קריפטות מעיים של סוסים בנקאיים וניצנים שהוקפאו הורחבו למחקרי אנטרואידים דו-ממדיים¹⁰.

1. השתמש בכ-700-1,000 ניצנים/קטעי קריפטה (40,000-50,000 תאים כאשר הם מנותקים לתאים בודדים) לכל תוספת טרנסוול. מצפים את תוספות transwell עם 42 μL של 0.05% Matrigel לפני הוספת enterocytes. יש לקבע את המטריגל על האינסרט על ידי דגירה למשך שעה בטמפרטורה של 37 ^{מעלות צלזיוס}. לשאוף את התווך הנוסף ולאפשר לטרנסוולים להתייבש במשך 30 דקות ללא כיסוי. הוסף 200 μL של מדיום DMEM-F12 לכל תוספת transwell ואחסן את הצלחת ב 37 ° C עד לשימוש.
2. שטפו את קציצות המטריגל המכילות את האורגנואידים עם PBS ולאחר מכן חשפו אותן ל-500 מיקרוליטר של שחזור תאים בזמן שהן על קרח. פיפטה אותם שוב ושוב כדי להבטיח אוסף מלא של תאים לתוך צינור 15 מ"ל.
3. צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C., להסיר את supernatant, ולהשעות את גלולת התא בנפח היעד של תא גזע אפיתל המעי (IESC) תווך. חישוב נפח היעד על ידי הכפלת המספר הרצוי של monolayers על ידי 200 μL של בינוני. (טבלה 1).
4. מצפים מראש מזרק 1 מ"ל במדיה IESC ושאפו את תרחיף התא דרך מחט 16 גרם. החליפו את מחט 16 גרם במחט 28 גרם והוציאו דרכה את תרחיף התא כדי לעודד הפרדה של האורגנואידים.
5. מקם 200 μL של תרחיף התא שנוצר לתוך הצד האפי של transwells מצופה ו 500 μL של IESC, כמו גם גורמי גדילה שתוארו קודם בצד הבסיסי של transwell להוסיף¹⁰. שנה את המדיה ואת גורמי הצמיחה כל 24-48 שעות עד שתגיע למפגש. הגדר מפגש כצפיפות התא המתאימה ל- TEER של 1,000 ohmsxcm ^2,11. למדידה, ראה שלב 5.1.

5. חדירות חד-שכבתית של אנטרוציט סוסים בעקבות חשיפה לציטוקינים דלקתיים ומוצרי גליה אנטריים של סוסים

1. השתמש בתא מדידה TEER בעל אלקטרודה כפולה כדי לכמת את ה-TEER על פני החד-שכבות וליצור קריאת בסיס על פני כל קרום חדיר לטרנסוול. ודא שלמדיה ולטרנסוול של IESC יש 15 דקות להגיע לטמפרטורת החדר לפני ביצוע המדידות. מלא את התרבית ב- 1.5 מ"ל של מדיית IESC וודא שבדיוק 200 מיקרוליטר של מדיה נמצאים בתוך תוספת הטרנסוול, כך שקווי הנוזל יתאימו בזמן המדידה.
2. יש לחשוף את האספקט הבזולטרלי של תוספות הטרנסוול לציטוקינים דלקתיים של 25 ng IL-1β, 10 ng ו-25 ng interleukin 6 (IL-6) לכל באר, או לתוצרי גלייה של תרביות שנחשפו ל-10 ng או 25 ng IL-1β. חשוף את ההיבט הבזולטרלי של החדרת טרנסוול הבקרה למדיית גליה, ומדיה גליה מתרביות שלא נחשפו ל- IL-1β.
3. מדדו את ה-TEER במשך 45 דקות במרווחים של 10-15 דקות על ידי הכנסת כל טרנסוול לכוס התרבית.

6. סטטיסטיקה

1. חשב את שינוי הקיפול של TEER של כל טרנסוול עבור נקודות הזמן: 0, 10, 20, 30 ו- 45 דקות.
2. תוך שימוש בתוכנה המועדפת (ראה טבלת חומרים), השווה את המתאמים בין ירידה ב-TEER לבין חשיפה בזולטרלית ל-IL-1β (25 ננוגרם), IL-6 (10 ננוגרם, 25 ננוגרם ו-100 ננוגרם) ומדיית גליה (חשופה ל-0 ננוגרם IL-1β, 10 ננוגרם IL-1β ו-25 ננוגרם IL-1β) כדי לשלוט במדיה באמצעות בדיקת t חד-זנבית לא מזווגת.

תוצאות

מיקרודיסקציה של סוסים ג'ג'ונום לשכבה התת-רירית (איור 1) עם עיכול אנזימטי ומכני נוסף, יכולה לייצר תרביות תאים בנות קיימא של גליה אנטרית של סוסים. התאים הדגימו פלומורפיזם עם דומיננטיות של תאים בצורת ציר התואמים את הגליה האנטרית של מינים אחרים (איו...

Discussion

מטרת מחקר זה הייתה לפתח שיטה חוזרת של תרבית ראשונית של גליה אנטרית תת-רירית של סוסים ולהדגים את יישומה למודל אינטראקציות אפיתל-גליה בזמן כאבי בטן. בידוד ותרבות גליה אנטרית, שהיא חדשנית בסוס, הוכחה כמועילה בהבנת מסלולי מחלות מעיים במודלים של חזירים ומכרסמים ובבני אדם

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution