Enterische Gliakultur bei Pferden und Anwendung zur Untersuchung eines neuronalen Entzündungsmechanismus bei Pferdekoliken

Zusammenfassung

Enterische Gliazellen werden zunehmend für ihre Rolle bei der Darmhomöostase und bei Krankheitsprozessen, einschließlich postoperativer Komplikationen, anerkannt. Equidenpatienten, die sich von einer explorativen Notfall-Laparotomie erholen, leiden unter einem hohen Risiko für entzündliche postoperative Erkrankungen, was die Bedeutung der Etablierung einer wiederholbaren enterischen Glia-Primärzellkultur für die Studie unterstreicht.

Zusammenfassung

Entzündliche postoperative Erkrankungen der Pferdekoliken (akutes Abdomen) tragen nicht nur zu erhöhten Kundenkosten, Patientenbeschwerden und Krankenhausaufenthalten bei, sondern erweisen sich in vielen Fällen als lebensbedrohlich. Eine einzigartige Population von Darmzellen, enterische Gliazellen, wird zunehmend für ihre Rolle bei der Wahrnehmung des gastrointestinalen Milieus und der Kommunikation mit den umgebenden Zelltypen anerkannt. Wechselwirkungen zwischen enterischen Gliazellen und Darmepithelien können sich als entscheidend erweisen, um festzustellen, wie enterische Gliazellen bei Pferden die Schleimhautbarriere verändern können, um Entzündungen bei Gesundheit und Koliken zu modulieren.

Um diese Interaktion zu untersuchen, stellen wir eine Methode vor, bei der primäre enterische Gliakulturen von Pferden aus equinem Jejunum etabliert und die Kulturen entzündlichen Zuständen ausgesetzt werden, von denen bekannt ist, dass sie bei Koliken vorhanden sind. Primäre enterische Gliakulturen wurden von erwachsenen Pferden gewonnen, die aus Gründen, die nichts mit Koliken zu tun hatten, euthanasiert wurden. Darmzotten und Lamina propria wurden mikropräpariert, um die Submukosa freizulegen. Die isolierte Submukosa wurde 2-3 Stunden lang enzymatisch mit Kollagenase, Protease und Rinderserumalbumin verdaut. Als nächstes ergab der mechanische Aufschluss mit Zentrifugation, Pipettieren und Zellsieben (40-100 μm) ein Pellet, das für die Beschichtung auf 0,05 mg/ml-Poly-L-Lysin-beschichteten Wells bei einer Konzentration von ~400.000 Zellen/300 μl Medium verwendet wurde.

Nach der Konfluenz und der ersten Passage wurden die enterischen Gliazellen dann 24 Stunden lang rekombinantem IL-1β (0, 10, 25 ng) ausgesetzt. Um epithelial-gliale Wechselwirkungen zum Zeitpunkt der Koliken zu modellieren, wurde Medium, das entweder durch Kontrollglia oder behandelte enterische Gliazellen kontaminiert wurde, direkt zu konfluenten jejunalen Monoschichten von Pferden hinzugefügt, während der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) mit einer EndOhm-Kammer mit zwei Elektroden gemessen wurde. Diese Daten zeigen nur eine von vielen potenziell wirkungsvollen Anwendungen der enterischen Gliakultur von Pferden.

Einleitung

Pferdekoliken sind die häufigste medizinische Beschwerde, die bei der Notfallkonsultation^{auftreten 1}. Da bis zu 17 % der Pferde eine chirurgische Korrektur benötigen, sollten die Bemühungen zur Verbesserung der postoperativen Ergebnisse im Vordergrund der pferdemedizinischen Forschung stehen². Derzeit haben postoperative Kolikpatienten ein hohes Risiko für mehrere lebensbedrohliche Erkrankungen, darunter Sepsis/endotoxämischer Schock (12,3 % der Patienten) und postoperativer Ileus (13,7 % der Patienten)³. Trotz Fortschritten bei der Behandlung postoperativer Kompl....

Protokoll

Enterale Glia-Primärkulturen von Pferden wurden von drei Pferden gewonnen, die aus Gründen, die nichts mit dieser Studie zu tun hatten, human euthanasiert und mit einer Überdosis eines Barbiturats eingeschläfert worden waren. Bei den für die Kulturstudien ausgewählten Pferden handelte es sich um erwachsene Pferde ohne Vorgeschichte von Magen-Darm-Erkrankungen.

1. Submuköse enterische Glia-Primärkultur bei Pferden

1. Züchten Sie epitheliale Monoschichten von Pferden aus Jejunalkrypten, die von drei verschiedenen erwachsenen Pferden stammen.
   1. 24-Well-Platten 2 h bei 37 °C oder üb....

Diskussion

Das Ziel dieser Studie war es, eine wiederholbare Methode zur Primärkultur von submukösen enterischen Gliazellen von Pferden zu entwickeln und ihre Anwendung zur Modellierung von Epithel-Glia-Interaktionen zum Zeitpunkt der Koliken zu demonstrieren. Die Isolierung und Kultur enterischer Gliazellen, die beim Pferd neu ist, hat sich als vorteilhaft für das Verständnis der Darmkrankheitswege in Schweine- und Nagetiermodellen sowie beim Menschen erwiesen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution