Enterische Gliakultur bei Pferden und Anwendung zur Untersuchung eines neuronalen Entzündungsmechanismus bei Pferdekoliken

Zusammenfassung

Enterische Gliazellen werden zunehmend für ihre Rolle bei der Darmhomöostase und bei Krankheitsprozessen, einschließlich postoperativer Komplikationen, anerkannt. Equidenpatienten, die sich von einer explorativen Notfall-Laparotomie erholen, leiden unter einem hohen Risiko für entzündliche postoperative Erkrankungen, was die Bedeutung der Etablierung einer wiederholbaren enterischen Glia-Primärzellkultur für die Studie unterstreicht.

Zusammenfassung

Entzündliche postoperative Erkrankungen der Pferdekoliken (akutes Abdomen) tragen nicht nur zu erhöhten Kundenkosten, Patientenbeschwerden und Krankenhausaufenthalten bei, sondern erweisen sich in vielen Fällen als lebensbedrohlich. Eine einzigartige Population von Darmzellen, enterische Gliazellen, wird zunehmend für ihre Rolle bei der Wahrnehmung des gastrointestinalen Milieus und der Kommunikation mit den umgebenden Zelltypen anerkannt. Wechselwirkungen zwischen enterischen Gliazellen und Darmepithelien können sich als entscheidend erweisen, um festzustellen, wie enterische Gliazellen bei Pferden die Schleimhautbarriere verändern können, um Entzündungen bei Gesundheit und Koliken zu modulieren.

Um diese Interaktion zu untersuchen, stellen wir eine Methode vor, bei der primäre enterische Gliakulturen von Pferden aus equinem Jejunum etabliert und die Kulturen entzündlichen Zuständen ausgesetzt werden, von denen bekannt ist, dass sie bei Koliken vorhanden sind. Primäre enterische Gliakulturen wurden von erwachsenen Pferden gewonnen, die aus Gründen, die nichts mit Koliken zu tun hatten, euthanasiert wurden. Darmzotten und Lamina propria wurden mikropräpariert, um die Submukosa freizulegen. Die isolierte Submukosa wurde 2-3 Stunden lang enzymatisch mit Kollagenase, Protease und Rinderserumalbumin verdaut. Als nächstes ergab der mechanische Aufschluss mit Zentrifugation, Pipettieren und Zellsieben (40-100 μm) ein Pellet, das für die Beschichtung auf 0,05 mg/ml-Poly-L-Lysin-beschichteten Wells bei einer Konzentration von ~400.000 Zellen/300 μl Medium verwendet wurde.

Nach der Konfluenz und der ersten Passage wurden die enterischen Gliazellen dann 24 Stunden lang rekombinantem IL-1β (0, 10, 25 ng) ausgesetzt. Um epithelial-gliale Wechselwirkungen zum Zeitpunkt der Koliken zu modellieren, wurde Medium, das entweder durch Kontrollglia oder behandelte enterische Gliazellen kontaminiert wurde, direkt zu konfluenten jejunalen Monoschichten von Pferden hinzugefügt, während der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) mit einer EndOhm-Kammer mit zwei Elektroden gemessen wurde. Diese Daten zeigen nur eine von vielen potenziell wirkungsvollen Anwendungen der enterischen Gliakultur von Pferden.

Einleitung

Pferdekoliken sind die häufigste medizinische Beschwerde, die bei der Notfallkonsultation^{auftreten 1}. Da bis zu 17 % der Pferde eine chirurgische Korrektur benötigen, sollten die Bemühungen zur Verbesserung der postoperativen Ergebnisse im Vordergrund der pferdemedizinischen Forschung stehen². Derzeit haben postoperative Kolikpatienten ein hohes Risiko für mehrere lebensbedrohliche Erkrankungen, darunter Sepsis/endotoxämischer Schock (12,3 % der Patienten) und postoperativer Ileus (13,7 % der Patienten)³. Trotz Fortschritten bei der Behandlung postoperativer Komplikationen besteht nach wie vor ein Bedarf an fortschrittlichen Behandlungen zur Vorbeugung oder Behandlung dieser Erkrankungen.

Neuere Forschungen haben den lokalen und systemischen Entzündungsstatus von Kolikpatienten hervorgehoben⁴. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass proinflammatorische Proteine wie der Tumornekrosefaktor (TNF) alpha, Interleukin 1β (IL-1β), Interleukin 6 (IL-6) und das Monozyten-Chemoattractant-Protein-1 in der Kolik-Darmschleimhaut im Vergleich zu normalem Darmgewebe signifikant erhöht sind⁴. Aus systemischer Sicht konnte gezeigt werden, dass ein erhöhter TNF-alpha-Spiegel im Darmgewebe mit einem erhöhten Risiko für einen postoperativen nasogastrischen Reflux von mehr als 2 l korreliert, ein allgemeines Maß für die postoperative Motilitätsdystilität⁴. Es ist auch bekannt, dass die Verabreichung von Interleukin, IL-1β und TNF alpha in der Lage ist, klinische Anzeichen eines septischen Schocks zu induzieren⁵.

Eine mögliche Erklärung für den entzündlichen Status von Kolik-Darmgewebe und dessen Zusammenhang mit postoperativen Komplikationen ist die Darmepithelbarriere. Im Gesundheitswesen stellen die Tight-Junction-Komplexe, die die einzelne Schicht des Säulenepithels verbinden, die den Darmtrakt auskleidet, eine funktionelle Barriere dar, um zu verhindern, dass der Luminalgehalt und seine bakteriellen Bestandteile den submukkösen Raum und den Blutkreislauf erreichen. Die Dehnung und Schädigung durch kolikassoziierte Darmverschlüsse und Darmmanipulationen während der Operation können jedoch diese Darmbarrierefunktion stören.

In Bezug auf die funktionellen Komponenten der Darmwand als Ganzes hat sich gezeigt, dass das submuköse enterische Glianetzwerk innerhalb des enterischen Nervensystems entscheidend für die pathophysiologische Entwicklung postoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit Entzündungswegen ist und ein spezifisches therapeutisches Ziel darstellen kann 6,7,8,9 . Enterische Gliazellen sind nicht nur im gesamten Magen-Darm-Trakt vorhanden, sondern fungieren auch als Sensoren der Darmumgebung, beeinflussen die Signalübertragung mit zahlreichen Zelltypen der Darmwand und regulieren direkt die Darmbarriere⁶. Es ist daher vertretbar anzunehmen, dass diese potenten Sensoren des Darms durch Verletzungen und Entzündungen aktiviert werden und eine akute Reaktion wie Veränderungen der Barrierepermeabilität hervorrufen könnten.

Diese Studie ist die erste, die die Kultur der enterischen Gliazellen von Pferden und insbesondere die Rolle entzündlicher enterischer Gliazellen bei Pferden für die Funktion der Darmbarriere beschreibt. In diesem Artikel stellen wir Methoden zur Primärkultur von submukösen enterischen Gliazellen bei Pferden und ihre Reaktion auf die Exposition gegenüber inflammatorischem IL-1β vor, die Bewertung der Wirkung von enterischen Gliaprodukten nach IL-1β-Exposition auf die Permeabilität von equinen Enterozyten-Monoschichten und eine mögliche Blockade durch die Anwendung von equinem Serum.

Protokoll

Enterale Glia-Primärkulturen von Pferden wurden von drei Pferden gewonnen, die aus Gründen, die nichts mit dieser Studie zu tun hatten, human euthanasiert und mit einer Überdosis eines Barbiturats eingeschläfert worden waren. Bei den für die Kulturstudien ausgewählten Pferden handelte es sich um erwachsene Pferde ohne Vorgeschichte von Magen-Darm-Erkrankungen.

1. Submuköse enterische Glia-Primärkultur bei Pferden

1. Züchten Sie epitheliale Monoschichten von Pferden aus Jejunalkrypten, die von drei verschiedenen erwachsenen Pferden stammen.
   1. 24-Well-Platten 2 h bei 37 °C oder über Nacht bei Raumtemperatur mit Beschichtungslösung beschichten, 2x mit sterilem Wasser waschen und bei Raumtemperatur lagern, bis die Zellen bereit für die Beschichtung sind.
   2. Nach der humanen Euthanasie wird innerhalb von 60 Minuten ein Teil des Jejunums entfernt und in kalte Ringer-Lösung auf Eis gelegt.
   3. Entnehmen Sie ein 10 cm langes Stück aus dem Jejunum und öffnen Sie es an der antimesenterialen Grenze, um nicht-lymphoide Regionen im Zentrum des Gewebes zu halten. Schneiden Sie die Portion auf einen ca. 7 cm x 7 cm großen Abschnitt. Spülen Sie das Taschentuch vor der Dissektion gut mit frischer Ringer-Lösung ab.
   4. Stecken Sie das Gewebe in kalter Ringer-Lösung oder PBS-Schleimhaut nach oben auf eine mit Silikonelastomer beschichtete Petrischale und dehnen Sie das Gewebe so weit wie möglich (Abbildung 1A).
   5. Entfernen Sie die Darmzotten mit einer gekrümmten Pinzette (Abbildung 1B), gefolgt von der Schicht der Lamina propria aus der etwa 5 cm x 5 cm großen nicht-lymphoiden Region (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Diese Schichten lösen sich leicht von der Submukosa (Abbildung 1B).
   6. Entfernen Sie die Submukosa in einem Blatt, indem Sie sie mit einer Mikrodissektionsschere an einer Ecke befreien und beobachten Sie die natürliche Trennung beim Abschälen der Submukosa von der inneren zirkulären Muskelschicht des Jejunums (Abbildung 1D).
   7. Zerkleinern Sie die gesammelte submuköse Schicht in 2-5 mm große Stücke und geben Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen, das 5 ml "Organo-FBS" (Tabelle 1), 0,825 mg Kollagenase, 5 mg Protease und 20 mg Rinderserumalbumin enthält. Inkubieren Sie das Gewebe für 2-3 h bei 37 °C für die enzymatische Verdauung.
   8. Nach der Inkubation 10 ml "Organo + FBS" bei Raumtemperatur hinzufügen, um die Enzymwirkung zu stoppen. Pipettieren Sie das Gewebegemisch ca. 15x mit einer serologischen 10-ml-Pipette auf und ab, um die Zellen vom Gewebe zu dissoziieren, und zentrifugieren Sie dann bei 3.000 × g für 3 min bei Raumtemperatur.
   9. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml PBS bei Raumtemperatur, indem Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette etwa 15x auf und ab pipettieren, um die Zellen vom Gewebe zu dissoziieren.
   10. Das konische Röhrchen bei 3.000 × g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 10 mL Raumtemperatur "Organo + FBS", indem Sie mit einer serologischen 10-ml-Pipette etwa 15x auf und ab pipettieren, um die Zellen vom Gewebe zu dissoziieren.
   11. Filtern Sie die Zellen nacheinander durch ein 100 μm, ein 70 μm und dann ein 40 μm porengroßes Zellsieb.
   12. Zentrifugieren Sie die filtrierten Zellen und Medien bei 3.000 × g für 3 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml "Organo + FBS".
   13. Mit Trypanblau färben, um lebende Zellen zu identifizieren und mit einem Hämozytometer zu zählen.
   14. Säen Sie etwa 400.000 Zellen in 300 μl "Organo + FBS" in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte aus und fügen Sie jeder Vertiefung Wachstumsfaktoren hinzu: N2 5 μl/Vertiefung, G5 5 μl/Vertiefung und B27 10 μl/Vertiefung. Stellen Sie die 24-Well-Platte in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ , damit die Zellen haften können. Vierundzwanzig Stunden später wechseln Sie das Medium auf "glia media" (Tabelle 1) mit den oben genannten Wachstumsfaktoren und wechseln Sie alle 48 Stunden (Abbildung 2).

2. Immunfluoreszenz-Zytologie

1. Züchten Sie die enterischen Gliazellen aus der Primärkultur (P0) (Schritt 2.1.14) auf 70-80% Konfluenz und passieren Sie sie einmal (P1).
2. Fixieren Sie die Primärkulturzellen (P0) in den Vertiefungen mit 4 % Paraformaldehyd für 5 Minuten, bevor Sie 0,1 % PBS-Azid auftragen.
3. Bereiten Sie eine Sättigungslösung vor, die aus PBS-Azid, 4 % Eselserum und 0,5 % Triton-X besteht. Geben Sie 300 μl Sättigungslösung in die Vertiefungen, um die Zellen 2 h lang bei Raumtemperatur zu permeabilisieren.
4. Der Primärantikörper für den Gliamarker, das saure Gliafibrillärprotein (GFAP), und der Primärantikörper für den Fibroblastenmarker, Alpha-Aktin der glatten Muskulatur, werden in Verdünnungen von 1:1.000 in Sättigungslösung für die Inkubation über Nacht bei 4 ^°C zugegeben.
5. Waschen Sie 3x mit PBS, bevor Sie den Sekundärantikörper für das Esel-Anti-Kaninchen-IgG Alexa Fluor 594 und das Anti-Maus-IgG Alexa Flour 488 für 2-3 h in einer Verdünnung von 1:500 in Sättigungslösung hinzufügen.
6. Färben Sie die Zellkerne mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer Verdünnung von 1:1.000 in PBS für 5 min.
7. Lagern Sie die Zellen nach drei Wäschen mit PBS in 0,1 % PBS-Azid.

3. Exposition der submukösen equinen enterischen Glia-Primärkultur IL-1β

1. Wenn die Zellen aus der ersten Passage (P1) eine Konfluenz von 70-80 % erreichen, führen Sie das IL-1β-Expositionsexperiment durch. Setzen Sie die Vertiefungen 24 Stunden lang 0 ng, 10 ng und 25 ng IL-1β aus. Nach 24 Stunden werden die Medien aus jeder Vertiefung bei -80 °C gelagert und gelagert.

4. Organoidkultur bei Pferden zur Herstellung von Enterozyten-Monoschichten

HINWEIS: In Anlehnung an das 2018 veröffentlichte Protokoll von Stewart et al. wurden die Darmkrypten und Knospen von Pferden, die einer Kryobank unterzogen worden waren, für 2D-enteroide Studien erweitert¹⁰.

1. Verwenden Sie ca. 700-1.000 Knospen/Kryptenfragmente (40.000-50.000 Zellen, wenn sie in einzelne Zellen dissoziiert werden) pro Transwell-Einsatz. Die Transwell-Einsätze vor der Zugabe der Enterozyten mit 42 μl 0,05 % Matrigel bestreichen. Lassen Sie das Matrigel 1 h bei 37 ^°C auf dem Einsatz fixieren. Saugen Sie das zusätzliche Medium an und lassen Sie die Transwells 30 Minuten lang unbedeckt trocknen. Geben Sie 200 μl DMEM-F12-Medium in jeden Transwell-Einsatz und lagern Sie die Platte bis zur Verwendung bei 37 °C.
2. Waschen Sie die Matrigel-Patties mit den Organoiden mit PBS und setzen Sie sie dann auf Eis 500 μl Cell Recovery aus. Pipettieren Sie sie wiederholt, um eine vollständige Sammlung der Zellen in einem 15-ml-Röhrchen zu gewährleisten.
3. Das Röhrchen wird 5 Minuten lang bei 4 °C bei 300 × g zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Zellpellet im Zielvolumen des Mediums für intestinale epitheliale Stammzellen (IESC) suspendiert. Berechnen Sie das Zielvolumen, indem Sie die gewünschte Anzahl an Monolagen mit 200 μl Medium multiplizieren. (Tabelle 1).
4. Eine 1-ml-Spritze in IESC-Medien vorcoaten und die Zellsuspension durch eine 16-G-Nadel aspirieren. Ersetzen Sie die 16-G-Nadel durch eine 28-G-Nadel und stoßen Sie die Zellsuspension durch diese Nadel aus, um die Trennung der Organoide zu fördern.
5. Es werden 200 μL der resultierenden Zellsuspension in die apikale Seite der beschichteten Transwells und 500 μL IESC sowie zuvor beschriebene Wachstumsfaktoren auf die basale Seite des Transwell-Einsatzes¹⁰ gegeben. Wechseln Sie die Medien und Wachstumsfaktoren alle 24-48 Stunden, bis die Konfluenz erreicht ist. Definieren Sie Konfluenz als die Zelldichte, die einem TEER von 1.000 Ohmsxcm ^2,11 entspricht. Zur Messung siehe Schritt 5.1.

5. Permeabilität der Monoschicht von Enterozyten bei Pferden nach Exposition gegenüber entzündlichen Zytokinen und enterischen Gliaprodukten bei Pferden

1. Verwenden Sie eine TEER-Messkammer mit zwei Elektroden, um den TEER über die Monoschichten zu quantifizieren und einen Basiswert für jede transwellpermeable Membran zu ermitteln. Stellen Sie sicher, dass das IESC-Medium und der Transwell 15 Minuten Zeit haben, um Raumtemperatur zu erreichen, bevor Sie Messungen durchführen. Füllen Sie den Kulturbecher mit 1,5 mL IESC-Medien und stellen Sie sicher, dass genau 200 μl Medium im Transwell-Einsatz vorhanden sind, damit die Flüssigkeitsleitungen zum Zeitpunkt der Messung übereinstimmen.
2. Der basolaterale Aspekt der Transwell-Inserts wird entweder entzündlichen Zytokinen von 25 ng IL-1β, 10 ng und 25 ng Interleukin 6 (IL-6) pro Vertiefung oder Gliaprodukten von Kulturen, die 10 ng oder 25 ng IL-1β ausgesetzt wurden, ausgesetzt. Der basolaterale Aspekt der Kontroll-Transwell-Insertionen wird dem Gliamedium und dem Gliamedium aus Kulturen, die nicht IL-1β ausgesetzt sind, ausgesetzt.
3. Messen Sie den TEER 45 Minuten lang in Abständen von 10-15 Minuten, indem Sie jeden Transwell in den Kulturbecher geben.

6. Statistik

1. Berechnen Sie die Faltenänderung des TEER jedes Transwells für die Zeitpunkte: 0, 10, 20, 30 und 45 min.
2. Vergleichen Sie unter Verwendung der Software Ihrer Wahl (siehe Materialtabelle) die Korrelationen zwischen einer verringerten TEER und einer basolateralen Exposition gegenüber IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng und 100 ng) und Gliamedien (exponiert mit 0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β und 25 ng IL-1β), um Medien mit einem ungepaarten einseitigen t-Test zu kontrollieren.

Ergebnisse

Die Mikrodissektion des equinen Jejunums in die submuköse Schicht (Abbildung 1) mit weiterem enzymatischem und mechanischem Verdau könnte lebensfähige Zellkulturen der enterischen Gliazellen des Pferdes erzeugen. Die Zellen zeigten einen Pleomorphismus mit einer Dominanz spindelförmiger Zellen, die mit den enterischen Gliazellen anderer Spezies übereinstimmt (Abbildung 2A). Die Kulturen waren positiv für den selektiven Gli...

Diskussion

Das Ziel dieser Studie war es, eine wiederholbare Methode zur Primärkultur von submukösen enterischen Gliazellen von Pferden zu entwickeln und ihre Anwendung zur Modellierung von Epithel-Glia-Interaktionen zum Zeitpunkt der Koliken zu demonstrieren. Die Isolierung und Kultur enterischer Gliazellen, die beim Pferd neu ist, hat sich als vorteilhaft für das Verständnis der Darmkrankheitswege in Schweine- und Nagetiermodellen sowie beim Menschen erwiesen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution