馬の腸管グリア培養と馬疝痛の神経炎症メカニズムの研究への応用

要約

腸内グリアは、腸の恒常性や術後合併症を含む疾患プロセスにおける役割についてますます認識されるようになっています。緊急の探索的開腹術から回復した馬の患者は、炎症性術後疾患のリスクが高いことに苦しんでおり、研究のために再現性のある馬の腸内グリア初代細胞培養を確立することの重要性が強調されています。

要約

ウマ疝痛(急性腹部)の炎症性術後状態は、クライアントの費用、患者の不快感、入院時間の増加に寄与するだけでなく、多くの場合、生命を脅かすことが証明されています。腸内細胞のユニークな集団である腸内グリアは、胃腸環境を感知し、周囲の細胞タイプとコミュニケーションをとる役割についてますます認識されています。腸内グリアと腸上皮との間の相互作用は、馬の腸内グリアが粘膜バリアを変化させて健康と疝痛の炎症を調節する方法を確立する上で重要であることが証明される可能性があります。

この相互作用を研究するために、ウマ空腸から一次ウマ腸グリア培養を確立し、培養物を疝痛に存在することが知られている炎症状態にさらす方法を提示します。一次腸管グリア培養物は、疝痛とは無関係の理由で安楽死させた成馬から得られた。腸絨毛と固有層をマイクロ解剖して粘膜下層を露出させました。単離された粘膜下組織体は、コラゲナーゼ、プロテアーゼ、およびウシ血清アルブミンによる酵素消化を2〜3時間受けました。次に、遠心分離、ピペッティング、および細胞ストレーナー(40-100 μm)を含む機械的消化により、0.05 mg/mLのポリ-L-リジンコーティングウェルに~400,000細胞/300 μLの培地の濃度でプレーティングするために使用されるペレットが得られました。

コンフルエンスと最初の継代に続いて、腸管グリア細胞をウマ組換えIL-1β(0、10、25 ng)に24時間曝露しました。疝痛時の上皮-グリア相互作用をモデル化するために、コントロールまたは治療された腸グリアのいずれかによって調整された培地を、二重電極EndOhmチャンバーを使用して経上皮電気抵抗(TEER)を測定しながら、コンフルエントなウマ空腸単層に直接追加しました。これらのデータは、ウマの腸管グリア培養の多くの潜在的影響力のある応用の1つに過ぎません。

概要

馬の疝痛は、緊急相談のための最も一般的な医学的提示の苦情^です1。これらの馬の最大17%が外科的矯正を必要としているため、術後の転帰を増やすための努力は、馬の^{医学研究の}最前線にあるべきです2。現在、術後疝痛患者は、敗血症/内毒素ショック(患者の12.3%)や術後イレウス(患者の13.7%)³など、生命を脅かすいくつかの障害のリスクが高くなっています。術後合併症の治療は進んでいるものの、これらの疾患の予防や治療には高度な治療法が引き続き求められています。

最近の研究では、疝痛患者の局所的および全身的な炎症状態が強調されています⁴.例えば、腫瘍壊死因子(TNF)α、インターロイキン1β(IL-1β)、インターロイキン6(IL-6)、単球化学誘引性タンパク質-1などの炎症誘発性タンパク質は、いずれも正常な腸組織と比較して、疝痛腸粘膜における発現が有意に増加することが示されている⁴。全身の観点から、腸組織における TNF アルファの増加は、術後経鼻胃逆流のリスク増加と相関していることが実証されています 2 L を超える、術後の運動障害^{の一般的な測定....}

プロトコル

馬の腸管グリア初代培養物は、この研究とは無関係の理由でバルビツール酸の過剰摂取で人道的に安楽死させた3頭の馬から得られました。培養研究のために選択された馬は、胃腸疾患の現在の病歴がない成馬でした。

1.粘膜下、ウマ、腸内グリア、一次培養

1. 3頭の別々の成馬馬から得られた空腸陰窩から馬の上皮単層を成長させます。
   1. 24ウェルプレートをコーティング溶液で37°Cで2時間または室温で一晩コーティングし、滅菌水で2回洗浄し、細胞がプレーティングの準備ができるまで室温で保存します。
   2. 人道的な安楽死に続いて、60分以内に空腸の一部を取り出し、氷の上の冷たいリンガー溶液に入れます。
   3. 空腸から10cmの部分を取り出し、非リンパ領域を組織の中心に保つために、無腸境界で開きます。部分を約7cmx7cmのセクションにトリミングします。解剖する前に、新しいリンガー溶液で組織をよくすすいでください。
   4. シリコンエラストマーでコーティングされたペトリ皿に組織を冷たいリンガー溶液またはPBS粘膜面を上にして固定し、組織をできるだけ伸ばします(図1A)。
   5. 湾曲した鉗子(図1B....

ディスカッション

この研究の目的は、ウマの粘膜下腸グリアの初代培養の再現性のある方法を開発し、疝痛時の上皮-グリア相互作用をモデル化するためのその応用を実証することでした。腸内グリアの分離と培養は、ウマでは新規であり、ブタとげっ歯類のモデル、およびヒトの腸疾患経路を理解するのに有益であることが証明されています6,7,13,14。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution