Coltura gliale enterica equina e applicazione allo studio di un meccanismo infiammatorio neurale nelle coliche equine

Riepilogo

Le glia enteriche stanno diventando sempre più riconosciute per il loro ruolo nell'omeostasi intestinale e nei processi patologici, comprese le complicanze postoperatorie. I pazienti equini che si stanno riprendendo da una laparotomia esplorativa d'urgenza soffrono di un alto rischio di condizioni infiammatorie postoperatorie, evidenziando l'importanza di stabilire una coltura di cellule primarie gliali enteriche equine ripetibili per lo studio.

Abstract

Le condizioni infiammatorie postoperatorie delle coliche equine (addome acuto) contribuiscono non solo all'aumento dei costi per il cliente, del disagio del paziente e del tempo di ospedalizzazione, ma in molti casi si rivelano pericolose per la vita. Una popolazione unica di cellule intestinali, la glia enterica, è sempre più riconosciuta per il suo ruolo nel percepire l'ambiente gastrointestinale e comunicare con i tipi di cellule circostanti. Le interazioni tra la glia enterica e gli epiteli intestinali possono rivelarsi fondamentali per stabilire come la glia enterica equina possa alterare la barriera mucosa per modulare l'infiammazione in salute e le coliche.

Per studiare questa interazione, presentiamo un metodo per stabilire colture gliali enteriche equine primarie da digiuno equino ed esporre le colture a condizioni infiammatorie note per essere presenti nelle coliche. Le colture gliali enteriche primarie sono state ottenute da cavalli adulti soppressi per motivi non correlati alle coliche. I villi intestinali e la lamina propria sono stati micro-sezionati per esporre la sottomucosa. La sottomucosa isolata è stata sottoposta a digestione enzimatica con collagenasi, proteasi e albumina sierica bovina per 2-3 ore. Successivamente, la digestione meccanica che coinvolge la centrifugazione, il pipettaggio e i filtri cellulari (40-100 μm), ha prodotto un pellet utilizzato per la placcatura su pozzetti rivestiti di poli-L-lisina da 0,05 mg/mL a una concentrazione di ~400.000 cellule/300 μL di terreno.

Dopo la confluenza e il primo passaggio, le cellule gliali enteriche sono state esposte a IL-1β ricombinante equina (0, 10, 25 ng) per 24 ore. Per modellare le interazioni epiteliale-gliale al momento della colica, il terreno condizionato dalla glia enterica di controllo o trattata è stato aggiunto direttamente ai monostrati digiunali equini confluenti durante la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) utilizzando una camera EndOhm a doppio elettrodo. Questi dati dimostrano solo una delle tante potenziali applicazioni di impatto della coltura gliale enterica equina.

Introduzione

La colica equina è il reclamo medico più diffuso per la consultazione di emergenza¹. Con fino al 17% di questi cavalli che richiedono una correzione chirurgica, gli sforzi per aumentare i risultati postoperatori dovrebbero essere in prima linea nella ricerca medica equina². Attualmente, i pazienti con coliche postoperatorie presentano un alto rischio di diversi disturbi potenzialmente letali, tra cui sepsi/shock endotossico (12,3% dei pazienti) e ileo postoperatorio (13,7% dei pazienti)³. Nonostante i progressi nel trattamento delle complicanze postoperatorie, continua ad esserci la necessità di trattamenti avanzati per prevenire o trattare queste condizioni.

Recenti ricerche hanno evidenziato lo stato infiammatorio locale e sistemico dei pazienti con coliche⁴. Ad esempio, è stato dimostrato che le proteine proinfiammatorie come il fattore di necrosi tumorale (TNF) alfa, l'interleuchina 1β (IL-1β), l'interleuchina 6 (IL-6) e la proteina chemioattrattiva dei monociti-1, hanno tutte dimostrato di aumentare significativamente l'espressione nella mucosa intestinale delle coliche rispetto al tessuto intestinale normale⁴. Da un punto di vista sistemico, è stato dimostrato che l'aumento del TNF alfa nel tessuto intestinale è correlato con un aumento del rischio di reflusso nasogastrico postoperatorio superiore a 2 L, una misura generale della dismotilità postoperatoria⁴. È anche noto che la somministrazione di interleuchina IL-1β e TNF alfa è in grado di indurre segni clinici di shock settico⁵.

Una potenziale spiegazione per lo stato infiammatorio del tessuto intestinale delle coliche e il suo legame con le complicanze postoperatorie è la barriera epiteliale intestinale. In salute, i complessi di giunzione stretta che collegano il singolo strato di epitelio colonnare che riveste il tratto intestinale forniscono una barriera funzionale per limitare il contenuto luminale e i suoi componenti batterici dal raggiungere lo spazio sottomucoso e il flusso sanguigno. Tuttavia, la distensione e il danno causati dall'ostruzione intestinale associata alle coliche e dalla manipolazione intestinale durante l'intervento chirurgico possono interrompere questa funzione di barriera intestinale.

In termini di componenti funzionali della parete intestinale nel suo complesso, la rete gliale enterica sottomucosa all'interno del sistema nervoso enterico ha dimostrato di essere cruciale nello sviluppo fisiopatologico delle complicanze postoperatorie associate alle vie infiammatorie e può fornire un bersaglio terapeutico specifico 6,7,8,9 . Non solo le glia enteriche sono presenti in tutto il tratto gastrointestinale, ma agiscono come sensori dell'ambiente intestinale, influenzano la segnalazione con numerosi tipi di cellule della parete intestinale e regolano direttamente la barriera intestinale⁶. È quindi giustificabile presumere che questi potenti sensori dell'intestino vengano attivati da lesioni e infiammazioni e possano produrre una risposta acuta come alterazioni della permeabilità della barriera.

Questo studio è il primo a descrivere la coltura della glia enterica equina e, più specificamente, il ruolo della glia enterica equina infiammatoria sulla funzione della barriera intestinale. Qui, presentiamo i metodi di coltura primaria della glia enterica sottomucosa equina e la loro risposta all'esposizione all'IL-1β infiammatoria, la valutazione dell'effetto dei prodotti gliali enterici dopo l'esposizione all'IL-1β sulla permeabilità dei monostrati di enterociti equini e il possibile blocco attraverso l'applicazione di siero equino.

Protocollo

Le colture primarie gliali enteriche equine sono state ottenute da tre cavalli sottoposti a eutanasia umana con un sovradosaggio di un barbiturico per ragioni non correlate a questo studio. I cavalli selezionati per gli studi colturali erano cavalli adulti senza precedenti di malattia gastrointestinale.

1. Coltura primaria gliale enterica equina sottomucosa

1. Coltiva monostrati epiteliali equini da cripte digiunali ottenute da tre cavalli equini adulti separati.
   1. Rivestire le piastre a 24 pozzetti con una soluzione di rivestimento per 2 ore a 37 °C o per una notte a temperatura ambiente, lavarle 2 volte con acqua sterile e conservarle a temperatura ambiente fino a quando le celle non sono pronte per la piastra.
   2. Dopo l'eutanasia umanitaria, entro 60 minuti, rimuovere una sezione del digiuno e metterla nella soluzione fredda di Ringer sul ghiaccio.
   3. Rimuovere una porzione di 10 cm dal digiuno e aprirla in corrispondenza del bordo anetimesenterico per mantenere le regioni non linfoidi al centro del tessuto. Taglia la porzione a una sezione di circa 7 cm x 7 cm. Sciacquare bene il fazzoletto con una soluzione fresca di Ringer prima della dissezione.
   4. Fissare il tessuto su una piastra di Petri rivestita di elastomero siliconico nella soluzione fredda di Ringer o con la mucosa PBS rivolta verso l'alto, allungando il tessuto il più possibile (Figura 1A).
   5. Rimuovere i villi intestinali con una pinza curva (Figura 1B) seguiti dallo strato di lamina propria dalla regione non linfoide di circa 5 cm x 5 cm (Figura 1C).
      NOTA: Questi strati si separano facilmente dalla sottomucosa (Figura 1B).
   6. Rimuovere la sottomucosa in un foglio liberandola con le forbici da microdissezione in un angolo e osservare la separazione naturale mentre si stacca la sottomucosa dallo strato muscolare circolare interno del digiuno (Figura 1D).
   7. Tritare lo strato sottomucoso raccolto in pezzi di 2-5 mm e metterli in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di "Organo-FBS" (Tabella 1), 0,825 mg di collagenasi, 5 mg di proteasi e 20 mg di albumina sierica bovina. Incubare il tessuto per 2-3 ore a 37 °C per la digestione enzimatica.
   8. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 mL di "Organo + FBS" a temperatura ambiente per arrestare l'azione enzimatica. Pipettare la miscela di tessuto su e giù circa 15 volte con una pipetta sierologica da 10 ml per dissociare le cellule dal tessuto e quindi centrifugare a 3.000 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.
   9. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 10 mL di PBS a temperatura ambiente pipettandolo nuovamente su e giù circa 15 volte con una pipetta sierologica da 10 mL per dissociare le cellule dal tessuto.
   10. Centrifugare la provetta conica a 3.000 × g per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 10 mL di temperatura ambiente "Organo + FBS" pipettando su e giù circa 15x con una pipetta sierologica da 10 mL per dissociare le cellule dal tessuto.
   11. Filtrare le cellule in serie attraverso un filtro cellulare da 100 μm, 70 μm e quindi un filtro cellulare di dimensioni porabili da 40 μm.
   12. Centrifugare le celle e i terreni filtrati a 3.000 × g per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di "Organo + FBS".
   13. Colorare con blu di tripano per identificare le cellule vive e contarle con un emocitometro.
   14. Seminare circa 400.000 cellule in 300 μL di "Organo + FBS" in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e aggiungere fattori di crescita a ciascun pozzetto: N2 5 μL/pozzetto, G5 5 μL/pozzetto e B27 10 μL/pozzetto. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per consentire alle cellule di aderire. Ventiquattro ore dopo, cambiare il terreno in "glia media" (Tabella 1) con i fattori di crescita sopra indicati e cambiare ogni 48 ore (Figura 2).

2. Citologia immunofluorescente

1. Far crescere le cellule gliali enteriche dalla coltura primaria (P0) (passaggio 2.1.14) alla confluenza del 70-80% e farle passare una volta (P1).
2. Fissare le cellule di coltura primaria (P0) nei pozzetti utilizzando paraformaldeide al 4% per 5 minuti prima dell'applicazione di azide PBS allo 0,1%.
3. Preparare una soluzione di saturazione composta da azoturo PBS, siero d'asina al 4% e Triton-X allo 0,5%. Aggiungere 300 μl di soluzione di saturazione ai pozzetti per permeabilizzare le celle per 2 ore a temperatura ambiente.
4. Aggiungere l'anticorpo primario per il marcatore gliale, la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e l'anticorpo primario per il marcatore dei fibroblasti, l'alfa actina della muscolatura liscia, a diluizioni 1:1.000 in soluzione di saturazione per l'incubazione notturna a 4 ^oC.
5. Lavare 3 volte con PBS prima di aggiungere l'anticorpo secondario per l'IgG anti-coniglio d'asino Alexa Fluor 594 e la farina IgG Alexa 488 anti-topo di capra a una diluizione 1:500 in soluzione di saturazione per 2-3 ore.
6. Colorare i nuclei con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) alla diluizione di 1:1.000 in PBS per 5 minuti.
7. Dopo tre lavaggi con PBS, conservare le cellule in azide PBS allo 0,1%.

3. Esposizione primaria a IL-1β in coltura gliale enterica equina sottomucosa

1. Quando le cellule del primo passaggio (P1) raggiungono il 70-80% di confluenza, eseguire l'esperimento di esposizione a IL-1β. Esporre i pozzetti a 0 ng, 10 ng e 25 ng di IL-1β per 24 ore. Dopo 24 ore, conservare e conservare il terreno da ciascun pozzetto a -80 °C.

4. Coltura di organoidi equini per la produzione di monostrati di enterociti

NOTA: Seguendo il protocollo di Stewart et al. pubblicato nel 2018, le cripte intestinali equine bancarie e le gemme che erano state crioconservate sono state ampliate per gli studi enteroidi 2D¹⁰.

1. Utilizzare circa 700-1.000 gemme/frammenti di cripta (40.000-50.000 cellule se dissociate in singole cellule) per inserto del pozzetto trans. Rivestire gli inserti transwell con 42 μl di Matrigel allo 0,05% prima dell'aggiunta degli enterociti. Lasciare fissare il Matrigel sull'inserto incubando per 1 ora a 37 ^oC. Aspirare il terreno extra e lasciare asciugare i pozzetti per 30 minuti scoperti. Aggiungere 200 μl di terreno DMEM-F12 a ciascun inserto del pozzetto e conservare la piastra a 37 °C fino al momento dell'uso.
2. Lavare le polpette Matrigel contenenti gli organoidi con PBS e poi esporle a 500 μL di Cell Recovery mentre sono in ghiaccio. Pipettarli ripetutamente per garantire la raccolta completa delle cellule in una provetta da 15 mL.
3. Centrifugare la provetta a 300 × g per 5 minuti a 4 °C., rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare nel volume target del terreno di cellule staminali epiteliali intestinali (IESC). Calcolare il volume target moltiplicando il numero desiderato di monostrati per 200 μL di terreno. (Tabella 1).
4. Predisporre una siringa da 1 mL in terreno IESC e aspirare la sospensione cellulare attraverso un ago da 16 G. Sostituire l'ago da 16 G con un ago da 28 G ed espellere la sospensione cellulare attraverso di esso per favorire la separazione degli organoidi.
5. Posizionare 200 μl della sospensione cellulare risultante nel lato apicale dei pozzetti rivestiti e 500 μl di IESC e i fattori di crescita precedentemente descritti sul lato basale dell'inserto del pozzetto¹⁰. Cambiare il terreno e i fattori di crescita ogni 24-48 ore fino a raggiungere la confluenza. Definisci la confluenza come la densità delle celle corrispondente a un TEER di 1.000 ohmxcm ^2,11. Per la misurazione, vedere il passaggio 5.1.

5. Permeabilità del monostrato degli enterociti equini in seguito all'esposizione a citochine infiammatorie e prodotti gliali enterici equini

1. Utilizzare una camera di misura TEER a doppio elettrodo per quantificare il TEER attraverso i monostrati e stabilire una lettura di base su ciascuna membrana permeabile al pozzetto. Assicurarsi che il terreno IESC e il pozzetto abbiano 15 minuti per raggiungere la temperatura ambiente prima di effettuare le misurazioni. Riempire la tazza di coltura con 1,5 mL di terreno IESC e assicurarsi che siano presenti esattamente 200 μL di terreno all'interno dell'inserto del pozzetto in modo che le linee del fluido corrispondano al momento della misurazione.
2. Esporre l'aspetto basolaterale degli inserti del transwell a citochine infiammatorie di 25 ng di IL-1β, 10 ng e 25 ng di interleuchina 6 (IL-6) per pozzetto, o a prodotti gliali di colture esposte a 10 ng o 25 ng di IL-1β. Esporre l'aspetto basolaterale degli inserti del pozzetto di controllo ai terreni gliali e ai terreni gliali provenienti da colture non esposte a IL-1β.
3. Misurare il TEER per 45 minuti a intervalli di 10-15 minuti posizionando ciascun pozzetto nella tazza di coltura.

6. Statistiche

1. Calcolare la variazione di piega del TEER di ciascun pozzetto per i punti temporali: 0, 10, 20, 30 e 45 min.
2. Utilizzando il software di scelta (vedere la Tabella dei materiali), confrontare le correlazioni tra la diminuzione del TEER e l'esposizione basolaterale a IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng e 100 ng) e ai mezzi gliali (esposti a 0 ng di IL-1β, 10 ng di IL-1β e 25 ng di IL-1β) per controllare i terreni utilizzando un t-test a una coda non accoppiato.

Risultati

La microdissezione del digiuno equino nello strato sottomucoso (Figura 1) con ulteriore digestione enzimatica e meccanica, potrebbe produrre colture cellulari vitali di glia enterica equina. Le cellule hanno dimostrato un pleomorfismo con una dominanza di cellule a forma di fuso coerente con la glia enterica di altre specie (Figura 2A). Le colture erano positive per il marcatore gliale selettivo, la proteina acida fibrillare gli...

Discussione

Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare un metodo ripetibile di coltura primaria della glia enterica sottomucosa equina e dimostrare la sua applicazione per modellare le interazioni epiteliali-gliali al momento della colica. L'isolamento e la coltura enterica della glia, che è una novità nel cavallo, si è dimostrata utile nella comprensione dei percorsi delle malattie intestinali nei modelli di suini e roditori e nell'uomo 6,7,13,14....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution