Coltura gliale enterica equina e applicazione allo studio di un meccanismo infiammatorio neurale nelle coliche equine

Riepilogo

Le glia enteriche stanno diventando sempre più riconosciute per il loro ruolo nell'omeostasi intestinale e nei processi patologici, comprese le complicanze postoperatorie. I pazienti equini che si stanno riprendendo da una laparotomia esplorativa d'urgenza soffrono di un alto rischio di condizioni infiammatorie postoperatorie, evidenziando l'importanza di stabilire una coltura di cellule primarie gliali enteriche equine ripetibili per lo studio.

Abstract

Le condizioni infiammatorie postoperatorie delle coliche equine (addome acuto) contribuiscono non solo all'aumento dei costi per il cliente, del disagio del paziente e del tempo di ospedalizzazione, ma in molti casi si rivelano pericolose per la vita. Una popolazione unica di cellule intestinali, la glia enterica, è sempre più riconosciuta per il suo ruolo nel percepire l'ambiente gastrointestinale e comunicare con i tipi di cellule circostanti. Le interazioni tra la glia enterica e gli epiteli intestinali possono rivelarsi fondamentali per stabilire come la glia enterica equina possa alterare la barriera mucosa per modulare l'infiammazione in salute e le coliche.

Per studiare questa interazione, presentiamo un metodo per stabilire colture gliali enteriche equine primarie da digiuno equino ed esporre le colture a condizioni infiammatorie note per essere presenti nelle coliche. Le colture gliali enteriche primarie sono state ottenute da cavalli adulti soppressi per motivi non correlati alle coliche. I villi intestinali e la lamina propria sono stati micro-sezionati per esporre la sottomucosa. La sottomucosa isolata è stata sottoposta a digestione enzimatica con collagenasi, proteasi e albumina sierica bovina per 2-3 ore. Successivamente, la digestione meccanica che coinvolge la centrifugazione, il pipettaggio e i filtri cellulari (40-100 μm), ha prodotto un pellet utilizzato per la placcatura su pozzetti rivestiti di poli-L-lisina da 0,05 mg/mL a una concentrazione di ~400.000 cellule/300 μL di terreno.

Dopo la confluenza e il primo passaggio, le cellule gliali enteriche sono state esposte a IL-1β ricombinante equina (0, 10, 25 ng) per 24 ore. Per modellare le interazioni epiteliale-gliale al momento della colica, il terreno condizionato dalla glia enterica di controllo o trattata è stato aggiunto direttamente ai monostrati digiunali equini confluenti durante la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) utilizzando una camera EndOhm a doppio elettrodo. Questi dati dimostrano solo una delle tante potenziali applicazioni di impatto della coltura gliale enterica equina.

Introduzione

La colica equina è il reclamo medico più diffuso per la consultazione di emergenza¹. Con fino al 17% di questi cavalli che richiedono una correzione chirurgica, gli sforzi per aumentare i risultati postoperatori dovrebbero essere in prima linea nella ricerca medica equina². Attualmente, i pazienti con coliche postoperatorie presentano un alto rischio di diversi disturbi potenzialmente letali, tra cui sepsi/shock endotossico (12,3% dei pazienti) e ileo postoperatorio (13,7% dei pazienti)³. Nonostante i progressi nel trattamento delle complicanze postoperatorie, con....

Protocollo

Le colture primarie gliali enteriche equine sono state ottenute da tre cavalli sottoposti a eutanasia umana con un sovradosaggio di un barbiturico per ragioni non correlate a questo studio. I cavalli selezionati per gli studi colturali erano cavalli adulti senza precedenti di malattia gastrointestinale.

1. Coltura primaria gliale enterica equina sottomucosa

1. Coltiva monostrati epiteliali equini da cripte digiunali ottenute da tre cavalli equini adulti separati.
   1. Rivestire le piastre a 24 pozzetti con una soluzione di rivestimento per 2 ore a 37 °C o per una notte a temperatur....

Discussione

Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare un metodo ripetibile di coltura primaria della glia enterica sottomucosa equina e dimostrare la sua applicazione per modellare le interazioni epiteliali-gliali al momento della colica. L'isolamento e la coltura enterica della glia, che è una novità nel cavallo, si è dimostrata utile nella comprensione dei percorsi delle malattie intestinali nei modelli di suini e roditori e nell'uomo 6,7,13,14........

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES buffer	Gibco	15630-080
10 mM HEPES	Life Technologies	15630-106
2 mM GlutaMAX	Life Technologies	25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol	Invitrogen	D3571
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody	Abcam	7817
Amphotericin B	Sigma	AA9529	4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x	Gibco	15240-096
B27	Gibco	12587010
Bovine Serum Albumin	Sigma	AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution	Sigma	A3311
CaCL2	ACROS Organiics	206791000	Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase	Sigma	9891
DMEM-F12 media	Thermo Fisher	11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Invitrogen	21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber	World Precision Instruments	EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement	World Precision Instruments	EVM-MT-03-01
G5	Gibco	17503012
Gentamicin solution	Sigma	G1272	Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody	Abcam	4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	28175
IL-1β ELISA	Thermo Fisher	ESIL1B
KCl	Thermo Fisher	P330-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution	Corning	25-00-Cl
Matrigel	BD Bioscience	354277
MgCl2	Thermo Fisher	M33-500	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2	Gibco	17502048
Na2HPO4	Thermo Fisher	BP332-1	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl	Thermo Fisher	S271-10	Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4	Thermo Fisher	BP329-500	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3	Thermo Fisher	S637-212	Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution	Gemini	400-109
Poly-L-lysine	Sigma	P2636	0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software	GraphPad
Protease	Sigma	P4630
Sodium bicarbonate solution	Sigma	S8761	7.5% stock solution