发育中的斑马鱼幼虫的双光子激光介导的成骨细胞消融

摘要

该协议描述了在斑马鱼幼虫中进行的双光子激光消融方法，该方法用作研究骨再生和免疫反应对消融的影响的模型。

摘要

斑马鱼 （Danio rerio） 具有出色的再生不同器官和附属物的能力。斑马鱼的骨骼再生已经使用不同的方法进行了研究，例如鳍截肢、拔鳞、颅骨环切和显微镜方法。使用配备双光子激光器的共聚焦激光扫描装置，开发了一种激光消融方法作为病变范式，以消融斑马鱼幼虫发育中的成骨细胞（成骨细胞）。这里描述的方法允许以精确的方式消融细胞，因为面积、形状和深度可以微调。此外，这种方法允许在消融之前和之后对区域进行成像，以便分析损伤的短期影响。在这个实验装置中，研究了受伤区域成骨细胞消融后的免疫反应。消融后观察到巨噬细胞募集的增加，表明它们在骨再生过程中存在的相关性。

引言

斑马鱼可以再生各种器官，例如视网膜、大脑、心脏和胰腺¹。此外，斑马鱼可以再生骨骼元素，这就是为什么它们被用来研究鳍、鳞片和颅骨（颅帽）的再生²。不同的实验范式已被用于研究组织和骨骼再生，例如鳍切除术（截肢）、鳍骨折、颅骨穿孔 ^3,4、冷冻损伤 ^5,6 或遗传消融 ^7,8,9。最近，激光消融方法已广泛用于斑马鱼，以研究受伤后的愈合和再生反应 10,11,12,13,14。

激光介....

研究方案

该研究方案获得了萨克森州州长的批准，许可证编号为 25-5131/564/2、DD25-5131/450/4、25-5131/496/56、DD25.1-5131/354/87。所使用的斑马鱼品系根据国家法律和标准化条件进行维护^{，如前所述 27,28}。材料表中列出了研究中使用的所有试剂和设备的详细信息。

1. 材料和溶液的制备

1. 将胚胎维持在 1x E3 培养基中。通过在 10 L 去离子水中稀释 170 mL 的 60x E3 原液并加入 2 mL 0.1% 亚甲蓝来制备 1x E3 培养基。
   1. 通过在 1 L 去离子高压灭菌水中混合 17.2 g NaCl、0.76 g KCl、2.90 g CaCl₂·2 H₂O、4.90 g MgSO₄·7 H₂O 来制备 60x E3 培养基储备液。
2. 对于幼虫包埋，提前准备 1% 低熔点琼脂糖 （LMA） 的等分试样，并将其保存在室温下。
   1. 要制备等分试样，将 LMA 溶解在 1x E3 培养基中，例如，在锥形瓶....

讨论

激光消融已应用于生物学研究的各个学科。特别是，它作为研究组织再生的方法很有用 10,11,12。例如，最近使用紫外激光或双光子激光消融测定分析了先天免疫细胞随时间的变化，以及激光消融位点成骨细胞的恢复¹⁰。免疫细胞募集的实时成像在病变后 12 小时 （hpl） 进行;但是，通?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware