Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Riepilogo

Questo protocollo descrive un approccio di ablazione laser a due fotoni effettuato su larve di zebrafish, che funge da modello per studiare la rigenerazione ossea e gli effetti della risposta immunitaria all'ablazione.

Abstract

Il pesce zebra (Danio rerio) ha un'eccezionale capacità di rigenerare diversi organi e appendici. La rigenerazione ossea nel pesce zebra è stata studiata utilizzando diversi metodi come l'amputazione delle pinne, la depilazione delle squame, la trapanazione del cranio e approcci microscopici. Utilizzando una configurazione di scansione laser confocale dotata di un laser a due fotoni, è stato sviluppato un metodo di ablazione laser come paradigma di lesione per l'ablazione delle cellule che formano l'osso (osteoblasti) nell'opercolo in via di sviluppo delle larve di zebrafish. Il metodo qui descritto consente l'ablazione delle cellule in modo preciso, poiché l'area, la forma e la profondità possono essere regolate con precisione. Inoltre, questo metodo consente l'imaging dell'area prima e subito dopo l'ablazione, in modo da poter analizzare gli effetti a breve termine della lesione. In questa configurazione sperimentale, è stata studiata la risposta immunitaria dopo l'ablazione degli osteoblasti nell'area lesa. Dopo l'ablazione è stato osservato un aumento del reclutamento dei macrofagi, indicando l'importanza della loro presenza durante la rigenerazione ossea.

Introduzione

Il pesce zebra rigenera diversi organi come la retina, il cervello, il cuore e il pancreas¹. Inoltre, il pesce zebra rigenera gli elementi scheletrici, motivo per cui è stato utilizzato per studiare la rigenerazione di pinne, squame e calvariae (calotte craniche)². Diversi paradigmi sperimentali sono stati utilizzati per studiare la rigenerazione tissutale e ossea, come la resezione delle pinne (amputazione), la frattura delle pinne, la trapanazione del cranio ^3,4, la criolesione ^5,6 o l'ablazio....

Protocollo

Il protocollo di studio ha ricevuto l'approvazione dalla Landesdirektion Sachsen, numeri di permesso 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. I ceppi di zebrafish utilizzati sono stati mantenuti secondo la legge nazionale e in condizioni standardizzate come descritto in precedenza^27,28. I dettagli di tutti i reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dei materiali e delle soluzioni

1. Mantenere gli embrioni in 1x ....

Discussione

L'ablazione laser è stata applicata in varie discipline della ricerca biologica. In particolare, è stato utile come metodo per studiare la rigenerazione tissutale 10,11,12. Ad esempio, il reclutamento e i cambiamenti fenotipici delle cellule immunitarie innate sono stati recentemente analizzati nel tempo utilizzando saggi di ablazione laser UV o laser a due fotoni, insieme al recupero di osteo.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware