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Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento
Neste Artigo
Resumo
Este protocolo descreve uma abordagem de ablação a laser de dois fótons realizada em larvas de peixe-zebra, que serve como modelo para estudar a regeneração óssea e os efeitos da resposta imune à ablação.
Resumo
O peixe-zebra (Danio rerio) tem uma excelente capacidade de regenerar diferentes órgãos e apêndices. A regeneração óssea em peixe-zebra tem sido estudada usando diferentes métodos, como amputação de barbatanas, arrancamento de escamas, trepanação de crânio e abordagens microscópicas. Usando uma configuração de varredura a laser confocal equipada com um laser de dois fótons, um método de ablação a laser foi desenvolvido como um paradigma de lesão para ablação de células formadoras de osso (osteoblastos) no opérculo em desenvolvimento de larvas de peixe-zebra. O método descrito aqui permite a ablação das células de maneira precisa, pois a área, a forma e a profundidade podem ser ajustadas com precisão. Além disso, esse método permite a obtenção de imagens da área antes e logo após a ablação, para que os efeitos de curto prazo da lesão possam ser analisados. Nesta configuração experimental, a resposta imune após a ablação de osteoblastos na área lesada foi estudada. Observou-se um aumento no recrutamento de macrófagos após a ablação, indicando a relevância de sua presença durante a regeneração óssea.
Introdução
O peixe-zebra regenera diversos órgãos, como retina, cérebro, coração e pâncreas1. Além disso, o peixe-zebra regenera elementos esqueléticos, razão pela qual tem sido usado para estudar a regeneração de barbatanas, escamas e calvárias (calotas cranianas)2. Diferentes paradigmas experimentais têm sido utilizados para estudar a regeneração tecidual e óssea, como ressecção de nadadeiras (amputação), fratura de nadadeiras, trepanação craniana 3,4, crioleferimento 5,6 ou ablação
Protocolo
O protocolo do estudo recebeu aprovação da Landesdirektion Sachsen, números de licença 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. As linhagens de peixe-zebra utilizadas foram mantidas de acordo com a legislação nacional e sob condições padronizadas, conforme descrito anteriormente27,28. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de materiais e soluções
- Mantenha os embriões em 1x meio E3. Prepare o meio ....
Resultados Representativos
A ablação a laser foi realizada conforme indicado no protocolo acima. O sinal GFP dos osteoblastos na área ablacionada desapareceu instantaneamente após a ablação. Para estudar a resposta da ablação de osteoblastos em termos de resposta imune, foi observada a presença de macrófagos em larvas de 6 dpf antes e em 6 hpl. Antes da ablação, muito poucos macrófagos foram observados na área do opérculo10 (Figura 2). Aos 6 hpl,.......
Discussão
A ablação a laser tem sido aplicada em várias disciplinas da pesquisa biológica. Em particular, tem sido útil como método para estudar a regeneração tecidual 10,11,12. Por exemplo, o recrutamento e as alterações fenotípicas das células imunes inatas foram recentemente analisados ao longo do tempo usando ensaios de ablação a laser UV ou laser de dois fótons, juntamente com a recupe.......
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) Transregio 67 (projeto 387653785), o DFG SPP 2084 μBone (projeto KN 1102/2-1) para FK. Este trabalho foi apoiado pela Light Microscopy Facility (DFG project 413875620), uma instalação central da Plataforma de Tecnologia CMCB na TU Dresden. Os trabalhos na TU Dresden foram cofinanciados com receitas fiscais baseadas no orçamento acordado pelo Parlamento da Saxónia («Landtag»).
....Materiais
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O | Carl Roth | 5239.1 | |
| Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm | Greiner Bio-one | 664160 | |
| Dumont #55 Foceps | FST | 11295-51 | Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm |
| Falcon 6-well plate | Corning | 353502 | |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated |
| Insight X3 multiphoton laser | Spectra-Physics | ||
| Leica Application Suite | LAS X, Leica Microsystems | ||
| Low melting agarose | Biozyme | 840101 | Biozym Plaque Agarose |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M5921 | |
| Mating cages | many varieties, e.g. Tecniplast | ||
| Methyleneblue | Carl Roth | A514.1 | |
| MS-222 | SIGMA Aldrich | A5040 | |
| Potassium Chloride, KCl | PanReac AppliChem | 131494 | |
| Sodium chloride, NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| SP8 FALCON | Leica Microsystems | Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software | |
| Stainless Steel Dissect Needle | Bochem | 12010 | 140 mm |
| Stereo Microscope System SZX16 | Olympus | Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ | |
| Thermostatic Cabinets TS - WTW | xylem | TS 608/2-i | For incubation (embryo) |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 861171 | 155 x 15 mm, LD-PE, transparent |
| Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0. | Zeiss | Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware |
Referências
- Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692 (2019).
- Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Min....
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