活细胞中的脂质交换测定

摘要

我们描述了一种使用环糊精介导质膜脂质与外源脂质之间交换的方法。该技术可以与研究跨膜蛋白的实验配对，这些蛋白在脂筏样环境中的行为与在非筏样环境中的行为不同。

摘要

脂筏是质膜中动态的有序结构域，通常在膜蛋白聚集和信号传导过程中形成。外小叶的脂质特性驱动膜形成脂筏的倾向。脂筏的瞬时性质使其难以在活细胞中进行研究。因此，在活细胞的外叶中添加或去除形成筏的脂质的方法有助于研究筏的特性，例如它们对膜蛋白的影响。我们实验室开发的脂质交换实验利用载脂环糊精去除和添加外源性磷脂以改变质膜的脂质组成。用筏或非筏形成脂质代替膜有助于研究对跨膜蛋白活性的影响。在这里，我们描述了一种使用载脂质的环糊精在质膜外小叶上进行脂质交换的方法。我们展示了交换培养基的制备和贴壁哺乳动物细胞的后续处理。我们还展示了如何使用 HP-TLC 测量交换效率。该方案产生外源性脂质几乎完全替换外小叶而不改变细胞活力，允许在修饰的完整质膜上进行进一步实验。

引言

质膜由富含各种膜蛋白（包括跨膜受体和离子通道）的脂质双层组成。膜内的脂质结构域已通过去污剂抗性膜 （DRM） 分级分离实验中鉴定的去污剂可溶性和不溶性区域进行阐明¹。不溶性馏分的特征是富含胆固醇、紧密堆积的鞘磷脂和饱和磷脂，表现出较高的熔点，而可溶性馏分主要由较低的熔解温度和松散堆积的不饱和磷脂组成。紧密堆积的区域称为液体有序 （Lo） 脂质结构域或脂筏，而组织更松散的液体无序 （Ld） 脂质结构域是质膜的非筏区域 ^2,3。已知脂筏区域可促进信号转导过程，有证据表明活性胰岛素受体与这些脂筏相关 ^4,5。然而，由于细胞膜的动态性质和结构域的通常较小尺寸，直接可视化活细胞中筏的存在存在重大挑战。在这种情况下，我们提出了一种通过脂质交换技术研究脂筏对胰岛素受体影响的方法。

环糊精 （CDs） 由连接的葡萄糖单体形成，这些葡萄糖单体形成具有中心腔的环状结构。该腔的大小由葡萄糖单元的数量决定：6 个单元形成 α-环糊精 （α-CD），而 7 个单元形成 β-环糊精 （β-CD）。CD 是高度水溶性的分子，能够将脂质封装在其腔内，从而促进它们转运到细胞膜⁶。β-环糊精已广泛用于添加和去除膜中的脂质⁷;然而，其较大的空腔对胆固醇或磷脂缺乏特异性⁸。相比之下，α-环糊精具有较小的腔体，在结合脂质分子方面表现出比甾醇更大的选择性。具体来说，甲基-α-环糊精 （methyl-α-CDs） 不与甾醇相互作用，已被有效地用于交换磷脂和鞘磷脂，而不会改变细胞膜的胆固醇组成 ^8,9。

在本手稿中，我们提供了使用甲基-α-CD （MαCD） 将细胞膜外小叶中的脂质与外源脂质交换的详细方案，这些脂质具有促进或破坏脂筏形成的特性。这种交换用于研究脂筏对胰岛素受体活性的影响。该演示将侧重于磷脂和鞘磷脂的引入，该磷脂和鞘磷脂会影响稳定过表达胰岛素受体 （IR） 的中国仓鼠卵巢 （CHO） 细胞系质膜中液体有序 （Lo） 结构域的形成¹⁰。CHO IR 细胞中脂质交换的程度将通过高效薄层色谱 （HP-TLC） 进行评估，而胰岛素受体活性的变化将在脂质交换后胰岛素刺激后通过蛋白质印迹分析进行量化。

研究方案

1. 甲基-α-CD 溶液的制备

1. 在玻璃瓶中将 20 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 添加到 ~10 g MαCD 粉末中。在温水浴 （45 °C） 中孵育以溶解，偶尔搅拌直至完全溶解。
   注：由于不溶性 CD 种类，溶液可能仍呈浑浊状态。
2. 将溶液通过 0.22 μm 针式过滤器。解决方案将变得清晰。
3. 使用折光仪确定 MαCD 的确切浓度。
   1. 将 10 μL 样品放在折光仪的样品区域，用白色白炽灯泡照射，并记录溶液的示差折光率。
   2. 使用方程式计算 MαCD 浓度
      RI = （1.49 x 10 x C） + 1.33
      其中 RI = 折光率，C = MαCD 浓度 （mM）。该方程是通过重量分析或测量溶解在已知体积中的已知重量的 MαCD 的折光率获得的。
4. 用盖子盖上玻璃瓶，用透明薄膜包裹盖子以防止蒸发。储存在 4 °C。

2. 多层囊泡 （MLV） 的制备

1. 保持溶解在氯仿中浓度为 20 mM 至 50 mM 的所需外源脂质的储备液，并储存在 -20 °C 或更低温度下，以尽量减少溶剂蒸发。
   注： 表 1 中的所有脂质都可以完全溶解在氯仿原液中。然而，替代脂质可能需要 1：1 氯仿：甲醇才能完全溶解。
2. 使用带有玻璃尖端的外置活塞式移液器将脂质原液分装到硼硅酸盐管中。或者，可以使用玻璃微量注射器。
3. 在 N₂ 气体流下，在约 50 °C 的低温加热块上干燥脂质等分试样，直到所有表观的氯仿蒸发。
4. 将试管放入真空室中，并将其暴露在高真空（低于 200 mTorr）中 1 小时，从干燥的脂质中去除剩余的溶剂。
5. 将无血清 Ham's F-12 培养基添加到干燥的脂质膜中，以达到 20 mM 的最终浓度。盖上盖子或特氟龙胶带，在 70 °C 水浴中加热 5 分钟。
6. 涡旋以悬浮脂质并形成 MLV。介质现在应该显示为云。
   注意：一些饱和脂质可能无法仅通过涡旋完全悬浮，可能需要通过上下移液来悬浮，直到胶片不再可见。
   1. 将整个体积转移到微量离心管中。MLV 可在 4 °C 下储存长达 3 天。

3. 脂质交换介质的制备

1. 加入 MαCD 原液至终浓度为 40 mM，并将制备的 MLV 加入至 表 1 中的最终脂质浓度。
   注意：如果使用储存在 4 °C 的 MLV，它们将沉淀在管的底部。预热至室温，并确保通过轻弹或搅动试管来重悬它们。
   1. 根据 表 1，通过在 37 °C 或 55 °C 水浴中孵育 30 分钟，将脂质加载到 MαCD 上。选择的温度应高于所选脂质的凝胶-液相熔点。介质应从多云变为晴朗。
   2. 让脂质交换培养基冷却至室温 30-60 分钟。

4. 细胞的脂质交换处理

1. 在 37 °C 和 5% CO₂ 中，在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、300 μg/mL L-谷氨酰胺、100 μg/mL 非必需氨基酸、50 μg/mL G418、2 μM 甲氨蝶呤和 1x 抗生素 - 抗真菌剂的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，4.5 g/L 葡萄糖）中培养 CHO IR 细胞。
   1. 在 60 mm 板中接种 1.5 x 10⁶ 个细胞，并生长至 80%-90% 汇合。
   2. 通过加入 1 mL PBS 然后吸出来洗涤细胞 3 次。在 2 mL 无血清 Ham's F12 培养基中将细胞饥饿过夜。
2. 用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次。向细胞中加入 1 mL 制备的交换培养基或无血清培养基作为对照，并在室温 （25 °C -27 °C） 下孵育 1 小时。每 15 分钟涡流一次细胞，以确保均匀暴露于交换介质中。
   1. 用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次。随后可以在步骤 5 中处理每个板以进行脂质提取，或在步骤 7 中处理 IR 自磷酸化。

5. 细胞培养板上的脂质提取

1. 完全去除 PBS，将板以 45° 角放置 10 分钟或直到完全干燥，去除可能沿底部聚集的任何缓冲液。
2. 向干燥的细胞中加入 1 mL 3：2 （v：v） 己烷：异丙醇溶液，并在室温下在摇床上孵育 10 分钟。
3. 将溶液转移到硼硅酸盐管中。用特氟龙胶带覆盖并储存在 -20 °C。
4. 通过加入 500 μL 1N NaOH 并在室温下摇动 10 分钟来溶解剩余的细胞碎片。
   1. 在蛋白质定量分析（如 Bradford 分析）中使用该溶液来确定每个样品的蛋白质浓度。这些浓度值可用于标准化 HP-TLC 板上脂质提取物的上样体积，以实现所有样品的脂质上样量相等。

6. 使用 HP-TLC 检查交换效率

1. 制作 100 mL 的 65：25：5 （v：v：v） 氯仿：甲醇：30% （v/v） 氢氧化铵，然后将其倒入玻璃 TLC 罐中。盖紧盖子，让蒸汽平衡至少 1 小时。
2. 在 N₂ 气体流下，将脂质提取物样品放在加热块上以低设置干燥，直到所有表观的有机溶剂蒸发。
3. 将脂质膜溶解在 50 μL 1：1 （v：v） 氯仿：甲醇中。
4. 使用 10 μL Hamilton 注射器在硅胶 HP-TLC 板上以 1 cm 条带加载 1-10 μL 样品。在 20 cm 板上加载最多 10 个条带。使用归一化值来确定在所有样品中上样等量脂质所需的体积。
   注意：在加载每个样品之前，应将其以中高设置放在热板上以激活板。
5. 将板直立放入 TLC 槽中，让溶剂前沿移动 8 cm，以确保磷脂种类的分离。
6. 让板干燥 10 分钟。喷洒 3% （w/v） 乙酸铜和 8% （v/v） 磷酸的水溶液。
   1. 让板在室温下或用热风枪干燥 30 分钟。板应从半透明蓝色变为不透明白色。
7. 在 180 °C-200 °C 的烘箱中炭化 5-10 分钟或直到可检测到黑色脂质带。

7. 使用自磷酸化测定和 western blot 检查受体激活

1. 在室温下，将细胞与 500 μL 100 nM 胰岛素在无血清培养基中孵育 5 分钟。
2. 用冰冷的 PBS 洗涤细胞，并将细胞置于冰上以停止刺激。立即向细胞中加入 1 mL 冰冷的 PBS，并用细胞刮刀收获。在 4 °C 下以 3000 x g 沉淀细胞 5 分钟。
3. 将 100-200 μL 完全 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris pH 8、200 mM NaCl、1 mM EDTA、1% （v/v） Triton X-100、1% （w/v） 脱氧胆酸钠、1 mM 活化原钒酸钠、10 μg/mL 抑肽酶、10 μg/mL 亮肽素）添加到冰上的细胞沉淀中。上下移液 30x-40x 以裂解。
4. 将裂解物在冰上孵育 10 分钟。通过在 4°C 下以 16,000 x g 旋转 10 分钟并收集上清液来清除细胞碎片的裂解物。保留约 20 μL 裂解物，以使用 Bradford 测定法测定蛋白质浓度。
5. 将裂解物与5x Laemmli缓冲液（350mM Tris HCl pH 6.8,30%v / v甘油，10%w / v SDS，25%v / v β-巯基乙醇，0.002g溴酚蓝）混合，并在95°C下煮沸5分钟。添加的缓冲液体积应足以达到 1x Laemmli 缓冲液的最终浓度。
6. 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 运行裂解物。
   1. 将所有样品的等质量蛋白质以及分子量标记物上样到 SDS-PAGE 凝胶上。在运行缓冲液（2.5 mM Tris pH 8、19.2 mM 甘氨酸、0.01% （w/v） SDS）中以 100 V-150 V 运行，直到在 100-250 kDa 范围内良好分离。
7. 在转移缓冲液（2.5 mM Tris pH 8,19.2 mM 甘氨酸）中，在 100V 和 4 °C 下转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上 1 小时。
8. 在室温下，在 TBST 中的 5% BSA 溶液（50 mM Tris pH 8、150 mM NaCl、0.1% （v/v） Tween 20）中封闭 PVDF 膜 30 分钟。
9. 与 pYpY IR 抗体或 IR-β 抗体在 1：1000 浓度的 TBST 溶液中，在 5% BSA 溶液中，在室温下孵育 1 小时或在 4 °C 下过夜。
   注：pYpY IR 抗体特异性识别磷酸化酪氨酸 1162 和 1163，并用于指示受体的自磷酸化。IR-β 抗体不加区分地识别受体的 β 亚基，无论磷酸化状态如何，并用于指示受体的整体水平。
10. 在室温下用 TBST 洗涤 3 次。在室温下α 1：3000 浓度的 Rabbit-HRP 抗体在 TBST 溶液中的 1% BSA 溶液中孵育 30 分钟。
11. 在室温下用 TBST 洗涤 3 次。与增强型化学发光 （ECL） 底物孵育 1 分钟，然后对胶片进行成像。

结果

为了证明交换后细胞脂质组成的可观察到的变化，我们在脑 SM （bSM） 和 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DOPC） 交换后对 CHO IR 细胞进行了 HP-TLC（图 1）。在使用鞘磷脂（如 bSM）进行交换的情况下，SM 条带强度明显增加，而相对于未处理的对照，PC 条带强度降低。相反，当像 DOPC 一样交换磷脂酰胆碱时，PC 带变得更强，而 SM 带变得不那么强烈。可以...

讨论

自从细胞膜中存在脂筏的概念化以来，已经进行了多次尝试在细胞中可视化它们并研究脂质和受体的结合。涉及细胞显微镜¹¹ 的实验使用荧光标记的生物标志物，通常是已知与筏相关的蛋白质和脂质，以直观地研究细胞中有序脂质结构域的定位¹²。然而，细胞膜上充满了褶皱^13,14、小窝内陷

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)	Avanti Polar Lipids	850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids	850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457
Anti-insulin receptor β antibody	Cell Signaling Technology	CST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibody	R&D Systems Inc.	AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)	Thermo Fisher Scientific	14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)	Avanti Polar Lipids	860062
Egg sphingomyelin (eSM)	Avanti Polar Lipids	860061
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-016-CV
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Gibco ham’s F12 media	Thermo Fisher Scientific	11765054
Gibco L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)	Merck	HP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF Membrane	Millipore	IPVH00010
Methotrexate	Sigma Aldrich	454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)	AraChem	CDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32106
Sodium orthovanadate, Activated	Sigma Aldrich	5.08605