Lipidaustausch-Assay in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Verwendung von Cyclodextrin, um den Austausch zwischen Lipiden der Plasmamembran und exogenen Lipiden zu vermitteln. Diese Technik kann mit Experimenten kombiniert werden, in denen Transmembranproteine untersucht werden, die sich in Lipid-Raft-ähnlichen Umgebungen anders verhalten als in nicht-Raft-ähnlichen Umgebungen.

Zusammenfassung

Lipid Rafts sind dynamische, geordnete Domänen in der Plasmamembran, die häufig während der Clusterbildung und Signalübertragung von Membranproteinen gebildet werden. Die Lipididentität des äußeren Segels treibt die Neigung der Membran zur Bildung von Lipidflößen an. Die flüchtige Natur von Lipid Rafts macht es schwierig, sie in lebenden Zellen zu untersuchen. Methoden, die Raft-bildende Lipide an der äußeren Falte lebender Zellen hinzufügen oder entfernen, erleichtern daher die Untersuchung der Eigenschaften von Rafts, wie z. B. ihrer Auswirkungen auf Membranproteine. Bei Lipidaustauschexperimenten, die in unserem Labor entwickelt wurden, werden lipidbeladene Cyclodextrine verwendet, um exogene Phospholipide zu entfernen und hinzuzufügen, um die Lipidkonstitution der Plasmamembran zu verändern. Die Substitution der Membran durch ein Raft- oder nicht-Raft-bildendes Lipid kann helfen, die Auswirkungen auf die Transmembranproteinaktivität zu untersuchen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zum Lipidaustausch auf dem äußeren Segel der Plasmamembran unter Verwendung von lipidbeladenem Cyclodextrin. Wir demonstrieren die Aufbereitung des Austauschmediums und die anschließende Behandlung von anhaftenden Säugetierzellen. Außerdem zeigen wir, wie Sie die Effizienz des Austauschs mit HP-TLC messen können. Dieses Protokoll führt zu einem nahezu vollständigen Ersatz des äußeren Segels durch exogene Lipide, ohne die zelluläre Lebensfähigkeit zu verändern, was weitere Experimente an modifizierten intakten Plasmamembranen ermöglicht.

Einleitung

Die Plasmamembran besteht aus einer Lipiddoppelschicht, die mit verschiedenen Membranproteinen angereichert ist, darunter Transmembranrezeptoren und Ionenkanäle. Lipiddomänen innerhalb der Membran wurden durch detergenslösliche und unlösliche Bereiche aufgeklärt, die in Fraktionierungsexperimenten mit detergensresistenten Membranen (DRM) identifiziert wurden¹. Die unlöslichen Fraktionen zeichneten sich dadurch aus, dass sie mit Cholesterin, dicht gepackten Sphingomyelinen und gesättigten Phospholipiden angereichert waren und höhere Schmelzpunkte aufwiesen, im Gegensatz zu den löslichen Fraktionen, die überwiegend aus niedrigeren Schmelztemperaturen und lose gepackten ungesättigten Phospholipiden bestehen. Die dicht gepackten Regionen werden als flüssigkeitsgeordnete (Lo) Lipiddomänen oder Lipid Rafts bezeichnet, während die lockerer organisierten flüssigkeitsungeordneten (Ld) Lipiddomänen die Nicht-Raft-Regionen der Plasmamembran sind ^2,3. Es ist bekannt, dass Lipid-Raft-Regionen Signalprozesse erleichtern, wobei Hinweise darauf hindeuten, dass der aktive Insulinrezeptor mit diesen Rafts assoziiert^{ist 4,5}. Aufgrund der dynamischen Natur der Zellmembran und der im Allgemeinen geringen Größe der Domänen stellt die direkte Visualisierung des Vorhandenseins von Rafts in lebenden Zellen jedoch eine große Herausforderung dar. In diesem Zusammenhang stellen wir eine Methode vor, um den Einfluss von Lipid Rafts auf den Insulinrezeptor durch Lipidaustauschtechniken zu untersuchen.

Cyclodextrine (CDs) bestehen aus verknüpften Glukosemonomeren, die eine ringförmige Struktur mit einem zentralen Hohlraum bilden. Die Größe dieses Hohlraums wird durch die Anzahl der Glukoseeinheiten bestimmt: Sechs Einheiten bilden Alpha-Cyclodextrin (α-CD), während sieben Einheiten Beta-Cyclodextrine (β-CDs) bilden. CDs sind hochgradig wasserlösliche Moleküle, die in der Lage sind, Lipide in ihrer Höhle einzukapseln und so ihren Transport zur Zellmembran zu erleichtern⁶. Beta-Cyclodextrine wurden in großem Umfang verwendet, um Lipide aus Membranen hinzuzufügen und zu entfernen⁷; Seinem größeren Hohlraum fehlt jedoch die Spezifität für Cholesterin oder Phospholipide⁸. Im Gegensatz dazu weisen Alpha-Cyclodextrine mit ihrem kleineren Hohlraum eine größere Selektivität bei der Bindung von Lipidmolekülen über Sterole auf. Insbesondere interagiert Methyl-α-Cyclodextrin (Methyl-α-CDs) nicht mit Sterolen und wurde wirksam zum Austausch von Phospholipiden und Sphingomyelinen eingesetzt, ohne die Cholesterinzusammensetzung der Zellmembran zu verändern ^8,9.

In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Methyl-α-CDs (MαCD) vor, um Lipide im äußeren Segel der Zellmembran mit exogenen Lipiden auszutauschen, die Eigenschaften haben, die die Lipid-Raft-Bildung entweder fördern oder stören. Dieser Austausch wird genutzt, um den Einfluss von Lipid Rafts auf die Insulinrezeptoraktivität zu untersuchen. Die Demonstration konzentriert sich auf die Einführung eines Phospholipids und eines Sphingomyelins, die die Bildung von flüssigkeitsgeordneten (Lo) Domänen in der Plasmamembran von Zelllinien des chinesischen Hamster-Eierstocks (CHO) beeinflussen, die den Insulinrezeptor (IR) stabil ^{überexprimieren10}. Das Ausmaß des Lipidaustauschs in den CHO-IR-Zellen wird durch Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HP-TLC) bewertet, während Veränderungen der Insulinrezeptoraktivität durch Western-Blot-Analyse nach Insulinstimulation nach dem Lipidaustausch quantifiziert werden.

Protokoll

1. Herstellung der Methyl-α-CD-Lösung

1. Geben Sie 20 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu ~10 g MαCD-Pulver in eine Glasflasche. In einem warmen Wasserbad (45 °C) inkubieren, um sich aufzulösen, und dabei gelegentlich umrühren, bis es sich gut aufgelöst hat.
   HINWEIS: Die Lösung kann aufgrund unlöslicher Zöliakie-Spezies noch trüb sein.
2. Die Lösung wird durch einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter geleitet. Die Lösung wird sich zeigen.
3. Verwenden Sie ein Refraktometer, um die genaue Konzentration von MαCD zu bestimmen.
   1. Legen Sie 10 μl Probe auf den Probenbereich eines Refraktometers, beleuchten Sie sie mit einer weißen Glühbirne und zeichnen Sie den Brechungsindex der Lösung auf.
   2. Berechnen Sie die MαCD-Konzentration mit der Gleichung
      RI = (1,49 x 10 x C) + 1,33
      wobei RI = Brechungsindex, C = Konzentration von MαCD (mM). Die Gleichung wurde durch gravimetrische Analyse oder Messung des Brechungsindex eines bekannten Gewichts von MαCD erhalten, das in einem bekannten Volumen gelöst ist.
4. Verschließen Sie die Glasflasche mit einem Deckel und wickeln Sie den Deckel in eine transparente Folie, um ein Verdampfen zu verhindern. Bei 4 °C lagern.

2. Präparation von multilamellären Vesikeln (MLVs)

1. Halten Sie Stammlösungen der gewünschten exogenen Lipide, die in Chloroform gelöst sind, in Konzentrationen von 20 mM bis 50 mM und lagern Sie sie bei -20 °C oder darunter, um die Verdunstung des Lösungsmittels zu minimieren.
   HINWEIS: Alle Lipide in Tabelle 1 können vollständig in Chloroform-Stämmen gelöst werden. Es ist jedoch möglich, dass alternative Lipide 1:1 Chloroform: Methanol benötigen, um sich vollständig aufzulösen.
2. Aliquotieren Sie das Lipidmaterial in Borosilikatröhrchen unter Verwendung einer Direktverdrängerpipette mit einer Glasspitze. Alternativ kann auch eine Mikrospritze aus Glas verwendet werden.
3. Das aliquotierte Lipid auf einem Heizblock bei einer niedrigen Einstellung von etwa 50 °C unter einem Strom von N₂ -Gas trocknen, bis das gesamte scheinbare Chloroform verdampft ist.
4. Entfernen Sie das restliche Lösungsmittel aus dem getrockneten Lipid, indem Sie das Röhrchen in eine Vakuumkammer stellen und es 1 h lang einem Hochvakuum (unter 200 mTorr) aussetzen.
5. Geben Sie serumfreies F-12-Medium von Ham zum trockenen Lipidfilm, um eine Endkonzentration von 20 mM zu erreichen. Mit einem Deckel oder Teflonband abdecken und in einem 70 °C warmen Wasserbad 5 Min. erhitzen.
6. Vortex, um Lipide zu suspendieren und MLVs zu bilden. Die Medien sollten nun wolkig erscheinen.
   HINWEIS: Einige gesättigte Lipide können durch das Vortexen allein nicht vollständig suspendiert werden und müssen möglicherweise durch Auf- und Abpipettieren suspendiert werden, bis der Film nicht mehr sichtbar ist.
   1. Übertragen Sie das gesamte Volumen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. MLVs können bis zu 3 Tage bei 4 °C gelagert werden.

3. Vorbereitung der Lipidaustauschmedien

1. Es wird MαCD-Stamm bis zu einer Endkonzentration von 40 mM zusammen mit vorbereiteten MLVs bis zu der in Tabelle 1 angegebenen Endlipidkonzentration zugegeben.
   HINWEIS: Bei Verwendung von MLVs, die bei 4 °C gelagert werden, setzen sie sich am Boden des Röhrchens ab. Erwärmen Sie sich auf Raumtemperatur und stellen Sie sicher, dass sie durch Schnippen oder Bewegen des Rohrs wieder aufgewirbelt werden.
   1. Die Lipide werden auf MαCD geladen, indem sie 30 Minuten lang in einem 37 °C oder 55 °C heißen Wasserbad inkubieren, wie in Tabelle 1 angegeben. Die gewählte Temperatur sollte über dem Schmelzpunkt der Gel-Flüssig-Phase des gewählten Lipids liegen. Die Medien sollten von wolkig zu klar wechseln.
   2. Lassen Sie das Lipidaustauschmedium 30-60 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen.

4. Behandlung des Lipidaustauschs von Zellen

1. Züchten Sie CHO-IR-Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, 4,5 g/l Glukose), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 300 μg/ml L-Glutamin, 100 μg/ml nicht-essentiellen Aminosäuren, 50 μg/ml G418, 2 μM Methotrexat und 1x Antibiotikum-Antimykotikum.
   1. 1,5 x 10⁶ Zellen in 60 mm Platten säen und wachsen, bis sie zu 80%-90% konfluent sind.
   2. Waschen Sie die Zellen 3x, indem Sie 1 mL PBS hinzufügen und dann aspirieren. Hungern Sie die Zellen über Nacht in 2 ml serumfreiem F12-Medium von Ham's.
2. Waschen Sie die Zellen 3x mit 1 mL PBS. Geben Sie 1 ml vorbereitetes Austauschmedium oder serumfreies Medium als Kontrolle zu den Zellen und inkubieren Sie es 1 h lang bei Raumtemperatur (25 °C -27 °C). Schwenken Sie die Zellen alle 15 Minuten, um eine gleichmäßige Exposition gegenüber Austauschmedien zu gewährleisten.
   1. Waschen Sie die Zellen 3x mit 1 mL PBS. Jede Platte kann anschließend für die Lipidextraktion in Schritt 5 oder für die IR-Autophosphorylierung in Schritt 7 verarbeitet werden.

5. Lipidextraktion auf Zellkulturplatte

1. Entfernen Sie PBS vollständig und stellen Sie die Platte 10 Minuten lang in einem Winkel von 45° auf, bis sie vollständig getrocknet ist, wobei Sie alle Puffer entfernen, die sich entlang der Unterseite ansammeln könnten.
2. Geben Sie 1 ml 3:2 (v:v) Hexan: Isopropanol-Lösung zu den getrockneten Zellen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf einem Schüttler bei Raumtemperatur.
3. Gib die Lösung in ein Borosilikatrohr. Mit Teflonband abdecken und bei -20 °C lagern.
4. Lösen Sie die restlichen Zelltrümmer auf, indem Sie 500 μl 1N NaOH hinzufügen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur schütteln.
   1. Verwenden Sie diese Lösung in einem Proteinquantifizierungsassay wie dem Bradford-Assay, um die Proteinkonzentration jeder Probe zu bestimmen. Diese Konzentrationswerte können verwendet werden, um die Beladungsvolumina der Lipidextrakte auf HP-DC-Platten zu normalisieren, um eine gleichmäßige Lipidbeladung über alle Proben zu erzielen.

6. Überprüfung der Austauscheffizienz mit HP-TLC

1. Stellen Sie 100 ml 65:25:5 (v:v:v) Chloroform:Methanol:30% (v/v) Ammoniumhydroxid her und gießen Sie es in einen DC-Glastank. Decken Sie es fest ab und lassen Sie den Dampf mindestens 1 h lang äquilibrieren.
2. Trockene Lipidextraktprobe auf einem Heizblock bei niedriger Einstellung unter einem_N2-Gasstrom , bis das gesamte sichtbare organische Lösungsmittel verdampft ist.
3. Lösen Sie den Lipidfilm in 50 μl 1:1 (v:v) Chloroform: Methanol auf.
4. Verwenden Sie eine 10-μl-Hamilton-Spritze, um 1-10 μl Probe in 1-cm-Banden auf eine Silica-HP-DC-Platte zu laden. Laden Sie maximal 10 Bänder auf eine 20 cm lange Platte. Verwenden Sie normierte Werte, um die Volumina zu bestimmen, die erforderlich sind, um gleiche Mengen an Lipiden über alle Proben zu laden.
   HINWEIS: Vor dem Laden jeder Probe sollte die Platte aktiviert werden, indem sie auf eine Heizplatte mit mittlerer bis hoher Einstellung gestellt wird.
5. Stellen Sie die Platte aufrecht in den DC-Tank und lassen Sie die Lösungsmittelfront 8 cm lang wandern, um die Trennung der Phospholipidspezies zu gewährleisten.
6. Den Teller 10 min trocknen lassen. Besprühen Sie es mit einer wässrigen Lösung aus 3 % (w/v) Kupferacetat und 8 % (v/v) Phosphorsäure.
   1. Lassen Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur oder mit einer Heißluftpistole trocknen. Die Platte sollte sich von durchscheinendem Blau zu Deckweiß verfärben.
7. Verkohlungsplatte in einem 180 °C-200 °C Ofen für 5-10 min oder bis die schwarzen Lipidbanden erkennbar sind.

7. Überprüfung der Rezeptoraktivierung mit Autophosphorylierungsassay und Western Blot

1. Inkubieren Sie die Zellen mit 500 μl 100 nM Insulin in serumfreien Medien bei Raumtemperatur für 5 min.
2. Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS und legen Sie die Zellen auf Eis, um die Stimulation zu stoppen. Geben Sie sofort 1 ml eiskaltes PBS zu den Zellen und ernten Sie mit einem Zellschaber. Pelletzellen bei 3000 x g für 5 min bei 4 °C.
3. Geben Sie 100-200 μl vollständigen RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % (v/v) Triton X-100, 1 % (w/v) Natriumdesoxycholat, 1 mM aktiviertes Natriumorthovanadat, 10 μg/mL Aprotinin, 10 μg/mL Leupeptin) zu dem Zellpellet auf Eis. Piptieren Sie 30x-40x auf und ab, um zu lysieren.
4. Inkubieren Sie das Lysat 10 Minuten lang auf Eis. Lysat von Zelltrümmern befreien, indem man 10 min lang bei 4 °C bei 16.000 x g schleudert und den Überstand auffängt. Reservieren Sie etwa 20 μl Lysat, um die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay zu bestimmen.
5. Lysat mit 5x Laemmli Puffer (350 mM Tris HCl pH 6,8, 30 % v/v Glycerin, 10 % w/v SDS, 25 % v/v β-Mercaptoethanol, 0,002 g Bromphenolblau) kombinieren und bei 95 °C 5 min kochen lassen. Das zugegebene Puffervolumen sollte ausreichend sein, um eine Endkonzentration von 1x Laemmli-Puffer zu erreichen.
6. Lassen Sie die Lysate durch die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) laufen.
   1. Laden Sie die gleiche Proteinmasse für alle Proben zusammen mit dem Molekulargewichtsmarker auf ein SDS-PAGE-Gel. Bei 100 V-150 V in Laufpuffer (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM Glycin, 0,01 % (w/v) SDS) bis zur guten Auflösung im Bereich von 100-250 kDa laufen.
7. 1 h bei 100 V und 4 °C auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran in Transferpuffer (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM Glycin) übertragen.
8. PVDF-Membran für 30 min bei Raumtemperatur in 5%iger BSA-Lösung in TBST (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20) blockieren.
9. Inkubieren Sie mit einem pYpY-IR-Antikörper oder einem IR-β-Antikörper in einer Konzentration von 1:1000 in 5%iger BSA-Lösung in TBST für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
   HINWEIS: Der pYpY-IR-Antikörper erkennt spezifisch phosphorylierte Tyrosine 1162 und 1163 und dient zur Anzeige einer Autophosphorylierung des Rezeptors. Der IR-β-Antikörper erkennt die Beta-Untereinheit des Rezeptors unterschiedslos unabhängig vom Phosphorylierungszustand und dient zur Anzeige der globalen Spiegel des Rezeptors.
10. 3x mit TBST bei Zimmertemperatur waschen. Inkubieren Sie mit α Kaninchen-HRP-Antikörper bei einer Konzentration von 1:3000 in 1%iger BSA-Lösung in TBST für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
11. 3x mit TBST bei Zimmertemperatur waschen. Inkubieren Sie 1 Minute lang mit Enhanced Chemiluminescent (ECL)-Substrat und belichten Sie den Film.

Ergebnisse

Um die beobachtbare Veränderung der zellulären Lipidzusammensetzung nach dem Austausch zu demonstrieren, führten wir HP-TLC an CHO IR-Zellen nach dem Austausch von SM (bSM) im Gehirn und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) durch (Abbildung 1). In Fällen, in denen Sphingomyeline wie bSM für den Austausch verwendet werden, ist eine Zunahme der SM-Bandenintensität offensichtlich, zusammen mit einer Abnahme der PC-Bandenintensität im Vergleich ...

Diskussion

Seit der Konzeptualisierung der Existenz von Lipid Rafts in der Zellmembran gab es zahlreiche Versuche, sie in Zellen sichtbar zu machen und die Assoziation von Lipiden und Rezeptoren zu untersuchen. Experimente mit der Mikroskopie¹¹ in Zellen verwendeten fluoreszenzmarkierte Biomarker, in der Regel Proteine und Lipide, von denen bekannt ist, dass sie mit Rafts assoziiert sind, um die Lokalisierung geordneter Lipiddomänen in der Zelle^{visuell zu ...}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)	Avanti Polar Lipids	850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids	850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457
Anti-insulin receptor β antibody	Cell Signaling Technology	CST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibody	R&D Systems Inc.	AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)	Thermo Fisher Scientific	14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)	Avanti Polar Lipids	860062
Egg sphingomyelin (eSM)	Avanti Polar Lipids	860061
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-016-CV
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Gibco ham’s F12 media	Thermo Fisher Scientific	11765054
Gibco L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)	Merck	HP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF Membrane	Millipore	IPVH00010
Methotrexate	Sigma Aldrich	454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)	AraChem	CDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32106
Sodium orthovanadate, Activated	Sigma Aldrich	5.08605