Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Plazma zarının lipitleri ile eksojen lipitler arasındaki değişime aracılık etmek için siklodekstrin kullanmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu teknik, lipid sal benzeri ortamlarda, sal benzeri olmayan ortamlarda olduğundan farklı davranan transmembran proteinleri inceleyen deneylerle eşleştirilebilir.

Özet

Lipid salları, genellikle zar protein kümelenmesi ve sinyalizasyonu sırasında oluşan plazma zarındaki dinamik, sıralı alanlardır. Dış broşürün lipit kimliği, zarın lipit salları oluşturma eğilimini yönlendirir. Lipid sallarının geçici doğası, canlı hücrelerde çalışmayı zorlaştırır. Bu nedenle, canlı hücrelerin dış broşürüne sal oluşturan lipitler ekleyen veya çıkaran yöntemler, salların zar proteinleri üzerindeki etkileri gibi özelliklerinin incelenmesini kolaylaştırır. Laboratuvarımızda geliştirilen lipid değişim deneyleri, plazma zarının lipid yapısını değiştirmek için eksojen fosfolipidleri çıkarmak ve eklemek için lipid yüklü siklodekstrinleri kullanır. Membranın bir sal veya sal oluşturmayan lipid ile değiştirilmesi, transmembran protein aktivitesi üzerindeki etkilerin incelenmesine yardımcı olabilir. Burada, lipid yüklü siklodekstrin kullanarak plazma zarının dış broşüründe lipit değişimi için bir yöntem tarif ediyoruz. Değişim ortamının hazırlanmasını ve daha sonra bağlı memeli hücrelerinin tedavisini gösteriyoruz. Ayrıca, HP-TLC kullanarak değişim verimliliğinin nasıl ölçüleceğini de gösteriyoruz. Bu protokol, hücresel canlılığı değiştirmeden dış broşürün eksojen lipitlerle neredeyse tamamen değiştirilmesini sağlar ve modifiye edilmiş sağlam plazma zarları üzerinde daha fazla deney yapılmasına izin verir.

Giriş

Plazma zarı, transmembran reseptörleri ve iyon kanalları dahil olmak üzere çeşitli zar proteinleri ile zenginleştirilmiş bir lipit çift tabakasından oluşur. Membran içindeki lipid alanları, deterjana dirençli membran (DRM) fraksiyonlama deneylerinde tanımlanan deterjanda çözünen ve çözünmeyen bölgeler aracılığıyla aydınlatılmıştır1. Çözünmeyen fraksiyonlar, ağırlıklı olarak daha düşük erime sıcaklığı ve gevşek bir şekilde paketlenmiş doymamış fosfolipidlerden oluşan çözünür fraksiyonların aksine, daha yüksek erime noktaları sergileyen kolesterol, sıkıca paketlenmiş sfingomyelinler ve doymuş fosfolipidler açısından zenginleştirilmiş olmaları ile karakterize edildi. Sıkıca paketlenmiş bölgeler, sıvı sıralı (Lo) lipid alanları veya lipid salları olarak adlandırılırken, daha gevşek organize edilmiş sıvı düzensiz (Ld) lipid alanları, plazma zarınınsal olmayan bölgeleridir 2,3. Lipid sal bölgelerinin sinyalleşme süreçlerini kolaylaştırdığı bilinmektedir ve aktif insülin reseptörünün bu sallarla ilişkili olduğunu gösteren kanıtlarvardır 4,5. Bununla birlikte, hücre zarının dinamik doğası ve genellikle küçük alan boyutu nedeniyle, canlı hücrelerde salların varlığını doğrudan görselleştirmek önemli zorluklar sunar. Bu bağlamda, lipid değişim teknikleri ile lipid sallarının insülin reseptörü üzerindeki etkisini araştırmak için bir yöntem sunuyoruz.

Siklodekstrinler (CD'ler), merkezi bir boşluğa sahip halka benzeri bir yapı oluşturan bağlı glikoz monomerleri tarafından oluşturulur. Bu boşluğun boyutu, glikoz birimlerinin sayısı ile belirlenir: altı birim alfa-siklodekstrin (α-CD) oluştururken, yedi birim beta-siklodekstrinler (β-CD'ler) oluşturur. CD'ler, lipitleri boşlukları içinde kapsülleyebilen ve böylece hücre zarınataşınmalarını kolaylaştırabilen suda çözünür moleküllerdir 6. Beta-siklodekstrinler, membranlara7 lipit eklemek ve çıkarmak için yaygın olarak kullanılmıştır; Bununla birlikte, daha büyük boşluğu kolesterol veya fosfolipitler için özgüllükten yoksundur8. Buna karşılık, alfa-siklodekstrinler, daha küçük boşluklarıyla, lipit moleküllerinin steroller üzerinde bağlanmasında daha fazla seçicilik sergiler. Spesifik olarak, metil-α-siklodekstrin (metil-α-CD'ler) sterollerle etkileşime girmez ve hücre zarının kolesterol bileşimini değiştirmeden fosfolipidleri ve sfingomyelinleri değiştirmek için etkili bir şekilde kullanılmıştır 8,9.

Bu yazıda, hücre zarının dış broşüründeki lipitleri, lipid sal oluşumunu teşvik eden veya bozan özelliklere sahip eksojen lipitlerle değiştirmek için metil-α-CD'lerin (MαCD) kullanılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu değişim, lipid sallarının insülin reseptör aktivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılır. Gösteri, Çin Hamster Yumurtalık (CHO) hücre hatlarının plazma zarında sıvı sıralı (Lo) alanların oluşumunu etkileyen ve insülin reseptörünü (IR) stabil bir şekilde aşırı eksprese eden bir fosfolipid ve sfingomyelinin eklenmesine odaklanacaktır.10. CHO IR hücrelerindeki lipid değişiminin derecesi, yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HP-TLC) ile değerlendirilirken, insülin reseptör aktivitesindeki değişiklikler, lipid değişimi sonrası insülin stimülasyonunu takiben western blot analizi ile ölçülecektir.

Protokol

1. Metil-α-CD çözeltisinin hazırlanması

  1. Bir cam şişede ~ 10 g MαCD tozuna 20 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Çözünmesi için ılık su banyosunda (45 °C) inkübe edin, iyice eriyene kadar ara sıra karıştırın.
    NOT: Çözünmeyen CD türleri nedeniyle çözelti hala bulanık olabilir.
  2. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden geçirin. Çözüm netleşecek.
  3. MαCD'nin tam konsantrasyonunu belirlemek için bir refraktometre kullanın.
    1. Bir refraktometrenin numune alanına 10 μL numune yerleştirin, beyaz bir akkor ampul kullanarak aydınlatın ve solüsyonun kırılma indisini kaydedin.
    2. Denklemi kullanarak MαCD konsantrasyonunu hesaplayın
      RI = (1.49 x 10 x C) + 1.33
      burada RI = Kırılma indisi, C = MαCD konsantrasyonu (mM). Denklem, gravimetrik analiz veya bilinen bir hacimde çözünmüş bilinen bir MαCD ağırlığının kırılma indisinin ölçülmesi yoluyla elde edildi.
  4. Cam şişeyi bir kapakla kapatın ve buharlaşmayı önlemek için kapağı şeffaf bir filmle sarın. 4 °C'de saklayın.

2. Çok katmanlı veziküllerin (MLV'ler) hazırlanması

  1. 20 mM ila 50 mM konsantrasyonlarda kloroformda çözünen istenen eksojen lipitlerin stok çözeltilerini koruyun ve solvent buharlaşmasını en aza indirmek için -20 °C veya altında saklayın.
    NOT: Tablo 1'deki tüm lipitler kloroform stoklarında tamamen çözülebilir. Bununla birlikte, alternatif lipitlerin tamamen çözünmesi için 1: 1 kloroform: metanol gerektirmesi mümkündür.
  2. Aliquot lipid stoğunu, cam uçlu pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanarak borosilikat tüplere yerleştirin. Alternatif olarak, bir cam mikroşırınga kullanılabilir.
  3. Lipit alikotunu, tüm görünür kloroform buharlaşana kadar bir N2 gazı akışı altında yaklaşık 50 ° C'lik düşük bir ayarda bir ısıtma bloğu üzerinde kurutun.
  4. Tüpü bir vakum odasına yerleştirerek ve 1 saat boyunca yüksek bir vakuma (200 mTorr'un altında) maruz bırakarak kalan çözücüyü kurutulmuş lipitten çıkarın.
  5. 20 mM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için serum içermeyen Jambon F-12 ortamını kuru lipit filme ekleyin. Bir kapak veya teflon bantla örtün ve 70 °C su banyosunda 5 dakika ısıtın.
  6. Lipitleri askıya almak ve MLV'ler oluşturmak için girdap. Medya artık bulutlu görünmelidir.
    NOT: Bazı doymuş lipitler, tek başına girdap ile tam olarak süspanse edilemeyebilir ve film artık görünmeyene kadar yukarı ve aşağı pipetleme ile süspanse edilmesi gerekebilir.
    1. Tüm hacmi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. MLV'ler 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.

3. Lipid değişim ortamının hazırlanması

  1. MαCD stoğunu 40 mM'lik bir nihai konsantrasyona ve hazırlanan MLV'lerle birlikte Tablo 1'de bulunan nihai lipid konsantrasyonuna ekleyin.
    NOT: 4 °C'de depolanan MLV'ler kullanılıyorsa, bunlar tüpün dibine yerleştirilecektir. Oda sıcaklığına ısıtın ve tüpü hafifçe vurarak veya çalkalayarak yeniden askıya alındıklarından emin olun.
    1. Tablo 1'e göre 37 ° C veya 55 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika inkübe ederek lipitleri MαCD üzerine yükleyin. Seçilen sıcaklık, seçilen lipitin jel-sıvı faz erime noktasının üzerinde olmalıdır. Medya bulutludan açık hale gelmelidir.
    2. Lipid değişim ortamını 30-60 dakika oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

4. Hücrelerin lipid değişimi tedavisi

  1. % 10 fetal sığır serumu (FBS), 300 μg / mL L-glutamin, 100 μg / mL esansiyel olmayan amino asitler, 50 μg / mL G418, 2 μM metotreksat ve 1x antibiyotik-antimikotik ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM, 4.5 g / L glikoz) 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de CHO IR hücrelerini büyütün.
    1. 60 mm'lik plakalarda 1.5 x 106 hücre tohumlayın ve% 80 -% 90 birleşene kadar büyütün.
    2. 1 mL PBS ekleyerek hücreleri 3 kez yıkayın ve ardından aspire edin. Hücreleri gece boyunca 2 mL serumsuz Ham's F12 ortamında aç bırakın.
  2. Hücreleri 1 mL PBS ile 3x yıkayın. Hücrelere kontrol olarak 1 mL hazırlanmış değişim ortamı veya serumsuz ortam ekleyin ve oda sıcaklığında (25 °C -27 °C) 1 saat inkübe edin. Değişim ortamına eşit şekilde maruz kalmayı sağlamak için hücreleri her 15 dakikada bir döndürün.
    1. Hücreleri 1 mL PBS ile 3x yıkayın. Her plaka daha sonra adım 5'te lipit ekstraksiyonu için veya adım 7'de IR otofosforilasyonu için işlenebilir.

5. Hücre kültürü plakasında lipit ekstraksiyonu

  1. PBS'yi tamamen çıkarın ve plakayı 10 dakika boyunca veya tamamen kuruyana kadar 45°'lik bir açıyla ayarlayın ve alt kısımda birikebilecek tamponları çıkarın.
  2. Kurutulmuş hücrelere 1 mL 3:2 (h:v) heksan: izopropanol çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika inkübe edin.
  3. Çözeltiyi bir borosilikat tüpe aktarın. Teflon bant ile örtün ve -20 °C'de saklayın.
  4. 500 μL 1N NaOH ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayarak kalan hücre kalıntılarını çözün.
    1. Bu çözeltiyi, her bir numunenin protein konsantrasyonunu belirlemek için Bradford Testi gibi bir protein miktar tayini testinde kullanın. Bu konsantrasyon değerleri, tüm numunelerde eşit lipid yüklemesi için HP-TLC plakaları üzerindeki lipid ekstraktlarının yükleme hacimlerini normalleştirmek için kullanılabilir.

6. HP-TLC ile değişim verimliliğini kontrol etme

  1. 100 mL 65:25:5 (v:v:v) kloroform:metanol:%30 (h/h) amonyum hidroksit yapın ve bir cam TLC tankına dökün. Sıkıca kapatın ve buharın en az 1 saat dengelenmesine izin verin.
  2. Lipid ekstrakt numunesini, görünen tüm organik çözücü buharlaşana kadar bir N2 gazı akışı altında düşük ayarda bir ısıtma bloğunda kurutun.
  3. Lipid filmi 50 μL 1: 1 (v: v) kloroform: metanol içinde çözün.
  4. 10 μL'lik bir Hamilton şırınga kullanarak 1-10 μL numune 1 cm'lik bantlar halinde bir silika HP-TLC plakasına yerleştirin. 20 cm'lik bir plakaya en fazla 10 bant yükleyin. Tüm numunelere eşit miktarda lipid yüklemek için gereken hacimleri belirlemek için normalleştirilmiş değerler kullanın.
    NOT: Her bir numuneyi yüklemeden önce, plaka orta-yüksek ayarda sıcak bir plaka üzerine yerleştirilerek etkinleştirilmelidir.
  5. Plakayı TLC tankına dik olarak yerleştirin ve fosfolipid türlerinin ayrılmasını sağlamak için çözücü ön kısmının 8 cm hareket etmesine izin verin.
  6. Plakayı 10 dakika kurumaya bırakın. %3 (a/h) bakırik asetat ve %8 (h/h) fosforik asitten oluşan sulu bir çözelti ile püskürtün.
    1. Plakayı oda sıcaklığında veya bir ısı tabancasıyla 30 dakika kurumaya bırakın. Plaka yarı saydam maviden opak beyaza dönmelidir.
  7. Kömür plakasını 180 °C-200 °C fırında 5-10 dakika veya siyah lipit bantları tespit edilebilir hale gelene kadar pişirin.

7. Otofosforilasyon testi ve western blot ile reseptör aktivasyonunun kontrol edilmesi

  1. Hücreleri 500 μL 100 nM İnsülin ile serumsuz ortamda oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  2. Hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve stimülasyonu durdurmak için hücreleri buzun üzerine koyun. Derhal hücrelere 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve bir hücre kazıyıcı ile hasat edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 3000 x g'da pelet hücreleri.
  3. 100-200 μL tam RIPA lizis tamponu (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, %1 (h/h) Triton X-100, %1 (a/h) sodyum deoksikolat, 1 mM aktif sodyum ortovanadat, 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL leupeptin) buz üzerindeki hücre peletine ekleyin. Parçalamak için 30x-40x yukarı ve aşağı pipetleyin.
  4. Lizatı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürerek ve süpernatanı toplayarak hücre kalıntılarının lizatını temizleyin. Bradford testi ile protein konsantrasyonunu belirlemek için yaklaşık 20 μL lizat ayırın.
  5. Lizatı 5x Laemmli tamponu (350 mM Tris HCl pH 6.8, %30 v/v gliserol, %10 w/v SDS, %25 v/v β-merkaptoetanol, 0.002 g bromofenol mavisi) ile birleştirin ve 95 ° C'de 5 dakika kaynatın. Eklenen tampon hacmi, 1x Laemmli tamponunun nihai konsantrasyonunu elde etmek için yeterli olmalıdır.
  6. Lizatları sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile çalıştırın.
    1. Moleküler ağırlık işaretleyicisi ile birlikte tüm numuneler için eşit kütlede protein yükleyin. 100-250 kDa aralığında iyi çözülene kadar çalışma tamponunda (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glisin,% 0,01 (a/h) SDS) 100 V-150 V'ta çalıştırın.
  7. 100V ve 4 ° C'de 1 saat boyunca transfer tamponunda (2.5 mM Tris pH 8, 19.2 mM glisin) bir poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın.
  8. TBST'de (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, %0.1 (h/h) Tween 20) içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PVDF membranı bloke edin.
  9. Oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca TBST içinde% 5 BSA çözeltisinde% 5 konsantrasyonda pYpY IR antikoru veya IR-β antikoru ile inkübe edin.
    NOT: pYpY IR antikoru, fosforile tirozinler 1162 ve 1163'ü spesifik olarak tanır ve reseptörün otofosforilasyonunu göstermeye yarar. IR-β antikoru, fosforilasyon durumundan bağımsız olarak reseptörün beta alt birimini tanır ve reseptörün global seviyelerini göstermeye yarar.
  10. 3 kez TBST ile oda sıcaklığında yıkayın. Oda sıcaklığında α dakika boyunca TBST içinde% 1 BSA çözeltisinde 1: 3000 konsantrasyonda 30 Tavşan-HRP antikoru ile inkübe edin.
  11. 3 kez TBST ile oda sıcaklığında yıkayın. Gelişmiş kemilüminesan (ECL) substrat ile 1 dakika inkübe edin ve filmi görüntüleyin.

Sonuçlar

Değişimden sonra hücresel lipid bileşimindeki gözlemlenebilir değişikliği göstermek için, beyin SM (bSM) ve 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) değişimini takiben CHO IR hücreleri üzerinde HP-TLC gerçekleştirdik (Şekil 1). BSM gibi sfingomyelinlerin değişim için kullanıldığı durumlarda, tedavi edilmeyen kontrole göre PC bant yoğunluğunda bir azalma ile birlikte SM bant yoğunluğunda bir artış belirgindir. Tersine, DOPC g...

Tartışmalar

Hücre zarında lipid sallarının varlığının kavramsallaştırılmasından bu yana, bunları hücrelerde görselleştirmek ve lipid ve reseptör ilişkisini incelemek için çok sayıda girişimde bulunulmuştur. Hücrelerde mikroskopi11'i içeren deneyler, hücre12'deki sıralı lipid alanlarının lokalizasyonunu görsel olarak incelemek için, genellikle sallarla ilişkili olduğu bilinen proteinler ve lipitler olmak üzere floresan...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Finansman, NIH hibesi GM 122493 tarafından sağlandı. CHO IR hücreleri, Dr Jonathan Whittaker'ın (Case Western Reserve Üniversitesi) nazik bir hediyesiydi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)Avanti Polar Lipids850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids850457
Anti-insulin receptor β antibodyCell Signaling TechnologyCST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibodyR&D Systems Inc.AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)Thermo Fisher Scientific14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)Avanti Polar Lipids860062
Egg sphingomyelin (eSM)Avanti Polar Lipids860061
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-016-CV
G418 disulfate saltSigma AldrichA1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)Thermo Fisher Scientific11965092
Gibco ham’s F12 mediaThermo Fisher Scientific11765054
Gibco L-glutamineThermo Fisher Scientific25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)MerckHP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF MembraneMilliporeIPVH00010
MethotrexateSigma Aldrich454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)AraChemCDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermo Fisher Scientific32106
Sodium orthovanadate, ActivatedSigma Aldrich5.08605

Referanslar

  1. Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Brown, D. A. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Physiology. 21, 430-439 (2006).
  3. Schroeder, R., London, E., Brown, D. Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).
  4. Suresh, P., Miller, W. T., London, E. Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains. J Biol Chem. 297 (3), 101010 (2021).
  5. Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).
  6. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).
  7. Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes. Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).
  8. Suresh, P., London, E. Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774 (2022).
  9. Li, G., et al. Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).
  10. Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).
  11. Gaus, K., et al. Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).
  12. Klymchenko, S., Kreder, R. Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells. Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).
  13. Pike, L. J. Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story. Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).
  14. Brown, D. A., London, E. Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes. Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).
  15. Lin, Q., London, E. Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry. PLoS One. 9 (1), e87903 (2014).
  16. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  17. Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. How lipid flippases can modulate membrane structure. Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).
  18. Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis. J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).
  19. Li, G., et al. Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity. PLoS One. 14 (10), e0223572 (2019).
  20. Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes. FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).
  21. Suresh, P., London, E. MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity. Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Lipid De i im DeneyiLipid SaltlarPlazma MembranMembran ProteinleriSiklodekstrinlerFosfolipidlerTransmembran Protein AktivitesiLipid kamesiMemeli H creleriHP TLCH cresel Canl l kD Bro rLipid Yap s

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır