Dosage de l’échange lipidique dans les cellules vivantes

Résumé

Nous décrivons une méthode d’utilisation de la cyclodextrine pour médier l’échange entre les lipides de la membrane plasmique et les lipides exogènes. Cette technique peut être associée à des expériences étudiant les protéines transmembranaires, qui se comportent différemment dans des environnements de type radeau lipidique que dans des environnements non semblables à un radeau.

Résumé

Les radeaux lipidiques sont des domaines dynamiques et ordonnés de la membrane plasmique souvent formés lors de l’agrégation et de la signalisation des protéines membranaires. L’identité lipidique de la foliole externe détermine la propension de la membrane à former des radeaux lipidiques. La nature transitoire des radeaux lipidiques rend difficile leur étude dans les cellules vivantes. Par conséquent, les méthodes qui ajoutent ou éliminent des lipides formant des radeaux au niveau du feuillet externe des cellules vivantes facilitent l’étude des caractéristiques des radeaux, telles que leurs effets sur les protéines membranaires. Les expériences d’échange de lipides développées dans notre laboratoire utilisent des cyclodextrines chargées de lipides pour éliminer et ajouter des phospholipides exogènes afin de modifier la constitution lipidique de la membrane plasmique. Le remplacement de la membrane par un radeau ou un lipide non formant un radeau peut aider à étudier les effets sur l’activité des protéines transmembranaires. Ici, nous décrivons une méthode d’échange de lipides sur le feuillet externe de la membrane plasmique à l’aide de cyclodextrine chargée de lipides. Nous démontrons la préparation du milieu d’échange et le traitement ultérieur des cellules de mammifères attachées. Nous montrons également comment mesurer l’efficacité des échanges à l’aide de HP-TLC. Ce protocole permet de remplacer presque complètement le feuillet externe par des lipides exogènes sans altérer la viabilité cellulaire, ce qui permet de poursuivre les expériences sur des membranes plasmiques intactes modifiées.

Introduction

La membrane plasmique est composée d’une bicouche lipidique enrichie de diverses protéines membranaires, notamment des récepteurs transmembranaires et des canaux ioniques. Les domaines lipidiques à l’intérieur de la membrane ont été élucidés à l’aide de régions solubles et insolubles au détergent identifiées dans des expériences de fractionnement de membranes résistantes aux détergents (DRM)¹. Les fractions insolubles ont été caractérisées par leur enrichissement en cholestérol, en sphingomyélines serrées et en phospholipides saturés, présentant des points de fusion plus élevés, contrairement aux fractions solubles qui consistent principalement en une température de fusion plus basse et en phospholipides insaturés faiblement emballés. Les régions étroitement tassées sont appelées domaines lipidiques ordonnés en liquide (Lo), ou radeaux lipidiques, tandis que les domaines lipidiques en désordre liquide (Ld) plus lâches sont les régions non en radeau de la membrane plasmique ^2,3. Les régions des radeaux lipidiques sont connues pour faciliter les processus de signalisation, avec des preuves indiquant que le récepteur actif de l’insuline s’associe à ces radeaux ^4,5. Cependant, en raison de la nature dynamique de la membrane cellulaire et de la taille généralement petite des domaines, la visualisation directe de la présence de radeaux dans les cellules vivantes présente des défis importants. Dans ce contexte, nous présentons une méthode pour étudier l’impact des radeaux lipidiques sur le récepteur de l’insuline par des techniques d’échange de lipides.

Les cyclodextrines (CD) sont formées de monomères de glucose liés qui créent une structure en forme d’anneau avec une cavité centrale. La taille de cette cavité est déterminée par le nombre d’unités de glucose : six unités forment de l’alpha-cyclodextrine (α-CD), tandis que sept unités créent des bêta-cyclodextrines (β-CD). Les CD sont des molécules très solubles dans l’eau capables d’encapsuler les lipides dans leur cavité, facilitant ainsi leur transport vers la membrane cellulaire⁶. Les bêta-cyclodextrines ont été largement utilisées pour ajouter et éliminer des lipides des membranes⁷ ; Cependant, sa cavité plus grande manque de spécificité pour le cholestérol ou les phospholipides⁸. En revanche, les alpha-cyclodextrines, avec leur cavité plus petite, présentent une plus grande sélectivité dans la liaison des molécules lipidiques par rapport aux stérols. Plus précisément, la méthyl-α-cyclodextrine (méthyl-α-CD) n’interagit pas avec les stérols et a été utilisée efficacement pour échanger des phospholipides et des sphingomyélines sans modifier la composition du cholestérol de la membrane cellulaire ^8,9.

Dans ce manuscrit, nous fournissons un protocole détaillé pour l’utilisation des méthyl-α-CD (MαCD) pour échanger des lipides dans la foliole externe de la membrane cellulaire avec des lipides exogènes qui ont des propriétés favorisant ou perturbant la formation de radeaux lipidiques. Cet échange est utilisé pour étudier l’impact des radeaux lipidiques sur l’activité des récepteurs de l’insuline. La démonstration se concentrera sur l’introduction d’un phospholipide et d’une sphingomyéline affectant la formation de domaines ordonnés par un liquide (Lo) dans la membrane plasmique de lignées cellulaires d’ovaire de hamster chinois (CHO) surexprimant de manière stable le récepteur de l’insuline (IR)¹⁰. L’étendue de l’échange lipidique dans les cellules IR CHO sera évaluée par chromatographie sur couche mince à haute performance (HP-TLC), tandis que les changements dans l’activité des récepteurs de l’insuline seront quantifiés par analyse par transfert Western après une stimulation insulinique post-échange lipidique.

Protocole

1. Préparation de la solution de méthyle-α-CD

1. Ajouter 20 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à ~10 g de poudre de MαCD dans un flacon en verre. Incuber dans un bain d’eau chaude (45 °C) pour dissoudre, en remuant de temps en temps jusqu’à ce qu’il soit bien dissous.
   REMARQUE : La solution peut encore être trouble en raison d’espèces de CD insolubles.
2. Faites passer la solution à travers un filtre à seringue de 0,22 μm. La solution deviendra claire.
3. Utilisez un réfractomètre pour déterminer la concentration exacte de MαCD.
   1. Placez 10 μL d’échantillon sur la zone de l’échantillon d’un réfractomètre, éclairez-le à l’aide d’une ampoule à incandescence blanche et enregistrez l’indice de réfraction de la solution.
   2. Calculer la concentration de MαCD à l’aide de l’équation
      IR = (1,49 x 10 x C) + 1,33
      où RI = indice de réfraction, C = concentration de MαCD (mM). L’équation a été obtenue par analyse gravimétrique, c’est-à-dire par mesure de l’indice de réfraction d’un poids connu de MαCD dissous dans un volume connu.
4. Fermez la bouteille en verre avec un couvercle et enveloppez le couvercle dans un film transparent pour éviter l’évaporation. Conserver à 4 °C.

2. Préparation des vésicules multilamellaires (MLV)

1. Conserver les solutions mères des lipides exogènes désirés dissous dans le chloroforme à des concentrations de 20 mM à 50 mM et les stocker à -20 °C ou moins pour minimiser l’évaporation du solvant.
   REMARQUE : Tous les lipides du tableau 1 peuvent être entièrement dissous dans les stocks de chloroforme. Cependant, il est possible que d’autres lipides nécessitent du chloroforme : méthanol 1:1 pour se dissoudre complètement.
2. Aliquote du stock lipidique dans des tubes borosilicatés à l’aide d’une pipette à déplacement positif avec une pointe en verre. Alternativement, une microseringue en verre peut être utilisée.
3. Sécher l’aliquote lipidique sur un bloc chauffant à basse température d’environ 50 °C sous un courant de gaz_N2 jusqu’à ce que tout le chloroforme apparent s’évapore.
4. Retirez le solvant restant du lipide séché en plaçant le tube dans une chambre à vide et en l’exposant à un vide poussé (moins de 200 mTorr) pendant 1 h.
5. Ajouter le milieu F-12 de Ham sans sérum sur un film lipidique sec pour atteindre une concentration finale de 20 mM. Couvrir avec un couvercle ou du ruban adhésif en téflon et chauffer au bain-marie à 70 °C pendant 5 min.
6. Vortex pour suspendre les lipides et former des MLV. Le support devrait maintenant apparaître trouble.
   REMARQUE : Certains lipides saturés peuvent ne pas être complètement suspendus par vortex seul et peuvent avoir besoin d’être suspendus en pipetant de haut en bas jusqu’à ce que le film ne soit plus visible.
   1. Transférez tout le volume dans un tube de microcentrifugation. Les MLV peuvent être stockés jusqu’à 3 jours à 4 °C.

3. Préparation des milieux d’échange de lipides

1. Ajouter le stock de MαCD à une concentration finale de 40 mM, ainsi que les MLV préparées à la concentration finale de lipides indiquée dans le tableau 1.
   REMARQUE : Si vous utilisez des MLV stockés à 4 °C, ils seront déposés au fond du tube. Réchauffez-les à température ambiante et assurez-vous qu’ils sont remis en suspension en effleurant ou en agitant le tube.
   1. Chargez les lipides sur MαCD en l’incubant pendant 30 min dans un bain-marie à 37 °C ou 55 °C conformément au tableau 1. La température choisie doit être supérieure au point de fusion de la phase gel-liquide du lipide choisi. Le milieu doit passer de nuageux à clair.
   2. Laisser refroidir le milieu d’échange de lipides à température ambiante pendant 30 à 60 min.

4. Traitement d’échange lipidique des cellules

1. Cultivez des cellules CHO IR à 37 °C et 5 % de CO₂ dans le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L de glucose) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 300 μg/mL de L-glutamine, 100 μg/mL d’acides aminés non essentiels, 50 μg/mL de G418, 2 μM de méthotrexate et 1x antibiotique-antimycosique.
   1. Ensemencez 1,5 x 10⁶ cellules dans des plaques de 60 mm et cultivez jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 80 % à 90 %.
   2. Lavez les cellules 3 fois en ajoutant 1 mL de PBS, puis en aspirant. Affamez les cellules pendant la nuit dans 2 ml de milieu F12 de Ham sans sérum.
2. Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS. Ajouter 1 mL de milieu d’échange préparé ou de milieu sans sérum comme témoin dans les cellules et incuber pendant 1 h à température ambiante (25 °C -27 °C). Faites tourner les cellules toutes les 15 minutes pour assurer une exposition uniforme aux milieux d’échange.
   1. Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS. Chaque plaque peut ensuite être traitée pour l’extraction des lipides à l’étape 5, ou pour l’autophosphorylation IR à l’étape 7.

5. Extraction des lipides sur plaque de culture cellulaire

1. Retirez complètement le PBS et placez la plaque à un angle de 45° pendant 10 minutes ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche, en enlevant tout tampon qui pourrait s’accumuler le long du fond.
2. Ajouter 1 mL de solution d’hexane 3:2 (v :v) : isopropanol aux cellules séchées et incuber pendant 10 min sur un agitateur à température ambiante.
3. Transférez la solution dans un tube en borosilicate. Couvrir d’un ruban adhésif en téflon et conserver à -20 °C.
4. Dissoudre les débris cellulaires restants en ajoutant 500 μL de NaOH 1N et en agitant pendant 10 minutes à température ambiante.
   1. Utilisez cette solution dans un test de quantification des protéines tel que le test de Bradford pour déterminer la concentration en protéines de chaque échantillon. Ces valeurs de concentration peuvent être utilisées pour normaliser les volumes de charge des extraits lipidiques sur les plaques HP-TLC pour une charge lipidique égale dans tous les échantillons.

6. Vérification de l’efficacité de l’échange avec HP-TLC

1. Préparez 100 ml d’hydroxyde d’ammonium 65:25:5 (v :v :v) chloroforme :méthanol :30 % (v/v) et versez-le dans un réservoir en verre TLC. Couvrez hermétiquement et laissez la vapeur s’équilibrer pendant au moins 1 h.
2. Sécher l’échantillon d’extrait lipidique sur un bloc chauffant à basse température sous un courant de gaz N₂ jusqu’à ce que tout le solvant organique apparent s’évapore.
3. Dissoudre le film lipidique dans 50 μL de chloroforme : méthanol 1:1 (v :v).
4. À l’aide d’une seringue Hamilton de 10 μL, chargez 1 à 10 μL d’échantillon en bandes de 1 cm sur une plaque de silice HP-TLC. Chargez un maximum de 10 bandes sur une plaque de 20 cm. Utilisez des valeurs normalisées pour déterminer les volumes nécessaires pour charger des quantités égales de lipides dans tous les échantillons.
   REMARQUE : Avant de charger chaque échantillon, la plaque doit être activée en la plaçant sur une plaque chauffante à un réglage moyen-élevé.
5. Placez la plaque à la verticale dans le réservoir de CCM et laissez le front du solvant se déplacer sur 8 cm pour assurer la séparation des espèces de phospholipides.
6. Laissez sécher la plaque pendant 10 min. Vaporiser une solution aqueuse d’acétate cuivrique à 3 % (p/v) et d’acide phosphorique à 8 % (v/v).
   1. Laissez sécher la plaque pendant 30 min à température ambiante ou avec un pistolet thermique. La plaque doit passer du bleu translucide au blanc opaque.
7. Carboniser la plaque dans un four à 180 °C-200 °C pendant 5 à 10 minutes ou jusqu’à ce que les bandes lipidiques noires deviennent détectables.

7. Vérification de l’activation du récepteur à l’aide d’un test d’autophosphorylation et d’un western blot

1. Incuber des cellules avec 500 μL d’insuline 100 nM dans un milieu sans sérum à température ambiante pendant 5 min.
2. Lavez les cellules avec du PBS glacé et mettez les cellules sur de la glace pour arrêter la stimulation. Ajoutez rapidement 1 ml de PBS glacé dans les cellules et récoltez à l’aide d’un grattoir cellulaire. Cellules à granulés à 3000 x g pendant 5 min à 4 °C.
3. Ajouter 100 à 200 μL de tampon de lyse RIPA complet (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM d’EDTA, 1 % (v/v) Triton X-100, 1 % (p/v) de désoxycholate de sodium, 1 mM d’orthovanadate de sodium activé, 10 μg/mL d’aprotinine, 10 μg/mL de leupeptine) à la pastille de cellule sur de la glace. Pipette de haut en bas 30x-40x pour lyser.
4. Incuber le lysat sur glace pendant 10 min. Éliminer le lysat des débris cellulaires en tournant à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C et en recueillant le surnageant. Réservez environ 20 μL de lysat pour déterminer la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford.
5. Mélanger le lysat avec 5 tampons Laemmli (350 mM Tris HCl pH 6,8, 30 % v/v de glycérol, 10 % p/v SDS, 25 % v/v β-mercaptoéthanol, 0,002 g de bleu de bromophénol) et faire bouillir à 95 °C pendant 5 min. Le volume de tampon ajouté doit être suffisant pour obtenir une concentration finale de 1x tampon Laemmli.
6. Analysez les lysats par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE).
   1. Chargez une masse égale de protéines pour tous les échantillons ainsi qu’un marqueur de poids moléculaire sur un gel SDS-PAGE. Fonctionner à 100 V-150 V dans un tampon de fonctionnement (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM de glycine, 0,01 % (p/v) SDS) jusqu’à ce qu’il soit bien résolu dans la plage de 100 à 250 kDa.
7. Transfert sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans un tampon de transfert (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glycine) pendant 1 h à 100V et 4 °C.
8. Bloquer la membrane PVDF pendant 30 min à température ambiante dans une solution BSA à 5 % dans du TBST (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween 20).
9. Incuber avec un anticorps IR pYpY ou un anticorps IR-β à une concentration de 1:1000 dans une solution BSA à 5 % dans du TBST pendant 1 h à température ambiante ou une nuit à 4 °C.
   REMARQUE : L’anticorps anti-IR pYpY reconnaît spécifiquement les tyrosines 1162 et 1163 phosphorylées et sert à indiquer l’autophosphorylation du récepteur. L’anticorps IR-β reconnaît la sous-unité bêta du récepteur sans distinction, quel que soit l’état de phosphorylation, et sert à indiquer les niveaux globaux du récepteur.
10. Laver 3 fois avec du TBST à température ambiante. Incuber avec α anticorps Rabbit-HRP à une concentration de 1:3000 dans une solution de BSA à 1 % dans du TBST pendant 30 min à température ambiante.
11. Laver 3 fois avec du TBST à température ambiante. Incuber avec un substrat chimiluminescent amélioré (ECL) pendant 1 min et imager le film.

Résultats

Pour démontrer le changement observable de la composition cellulaire des lipides après l’échange, nous avons effectué HP-TLC sur des cellules IR CHO après un échange cérébral SM (bSM) et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) (Figure 1). Dans les cas où des sphingomyélines comme bSM sont utilisées pour l’échange, une augmentation de l’intensité de la bande SM est apparente, ainsi qu’une diminution de l’intensité de la bande P...

Discussion

Depuis la conceptualisation de l’existence de radeaux lipidiques dans la membrane cellulaire, il y a eu de nombreuses tentatives pour les visualiser dans les cellules et étudier l’association des lipides et des récepteurs. Des expériences impliquant la microscopie¹¹ dans des cellules ont utilisé des biomarqueurs marqués par fluorescence, généralement des protéines et des lipides connus pour s’associer à des radeaux, pour étudier visuellement la loc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)	Avanti Polar Lipids	850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids	850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457
Anti-insulin receptor β antibody	Cell Signaling Technology	CST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibody	R&D Systems Inc.	AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)	Thermo Fisher Scientific	14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)	Avanti Polar Lipids	860062
Egg sphingomyelin (eSM)	Avanti Polar Lipids	860061
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-016-CV
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Gibco ham’s F12 media	Thermo Fisher Scientific	11765054
Gibco L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)	Merck	HP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF Membrane	Millipore	IPVH00010
Methotrexate	Sigma Aldrich	454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)	AraChem	CDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32106
Sodium orthovanadate, Activated	Sigma Aldrich	5.08605