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요약

우리는 원형질막의 지질과 외인성 지질 사이의 교환을 매개하기 위해 시클로덱스트린을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 지질 뗏목과 같은 환경에서 뗏목과 같은 환경이 아닌 뗏목과 같은 환경에서 다르게 행동하는 막관통 단백질을 연구하는 실험과 쌍을 이룰 수 있습니다.

초록

지질 뗏목(lipid rafts)은 원형질막(plasma membrane)에서 종종 막 단백질 클러스터링(membrane protein clustering) 및 신호전달(signaling) 중에 형성되는 동적이고 정렬된 도메인입니다. 바깥쪽 소엽의 지질 정체성은 막이 지질 뗏목을 형성하는 경향을 주도합니다. 지질 뗏목의 일시적인 특성으로 인해 살아있는 세포에서 연구하기가 어렵습니다. 따라서 살아있는 세포의 바깥쪽 소엽에서 뗏목을 형성하는 지질을 추가하거나 제거하는 방법은 막 단백질에 미치는 영향과 같은 뗏목의 특성을 연구하는 데 도움이 됩니다. 본 연구실에서 개발한 지질 교환 실험에서는 지질이 적재된 사이클로덱스트린을 사용하여 외인성 인지질을 제거 및 첨가하여 원형질막의 지질 구성을 변화시킵니다. 멤브레인을 래프트 또는 비래프트 형성 지질로 대체하면 막관통 단백질 활성에 미치는 영향을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 지질이 적재된 시클로덱스트린을 사용하여 원형질막의 외부 소엽에서 지질을 교환하는 방법을 설명합니다. 우리는 교환 배지의 준비와 부착된 포유류 세포의 후속 처리를 보여줍니다. 또한 HP-TLC를 사용하여 교환의 효율성을 측정하는 방법도 소개합니다. 이 프로토콜은 세포 생존력을 변경하지 않고 외부 전단지를 외인성 지질로 거의 완전히 대체하여 변형된 원형질막에 대한 추가 실험을 가능하게 합니다.

서문

원형질막(plasma membrane)은 막관통 수용체(transmembrane receptor) 및 이온 채널(ion channel)을 포함한 다양한 막 단백질이 풍부한 지질 이중층(lipid bilayer)으로 구성되어 있습니다. 멤브레인 내의 지질 도메인은 세제 내성 멤브레인(DRM) 분별 실험에서 확인된 세제 용해성 및 불용성 영역을 통해 설명되었습니다1. 불용성 분획은 콜레스테롤이 풍부하고, 단단히 채워진 스핑고미엘린 및 포화 인지질이 특징이며, 주로 낮은 용융 온도와 느슨하게 채워진 불포화 인지질로 구성된 용해성 분획과 달리 더 높은 융점을 나타냅니다. 빽빽하게 채워진 영역은 액체 정렬(Lo) 지질 도메인 또는 지질 뗏목이라고 하며, 보다 느슨하게 조직된 액체 무질서(Ld) 지질 영역은 원형질막의 비뗏목 영역입니다 2,3. 지질 뗏목 영역은 신호 전달 과정을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 활성 인슐린 수용체가 이러한 뗏목과 연관되어 있다는 증거가 있습니다 4,5. 그러나 세포막의 역동적인 특성과 일반적으로 도메인 크기가 작기 때문에 살아있는 세포에 뗏목의 존재를 직접 시각화하는 것은 상당한 도전입니다. 이러한 맥락에서 우리는 지질 교환 기술을 통해 인슐린 수용체에 대한 지질 뗏목의 영향을 조사하는 방법을 제시합니다.

사이클로덱스트린(CD)은 중앙 공동이 있는 고리 모양의 구조를 만드는 연결된 포도당 단량체에 의해 형성됩니다. 이 공동의 크기는 포도당 단위의 수에 의해 결정되며, 6개 단위는 알파-사이클로덱스트린(α-CD)을 형성하고 7개 단위는 베타 사이클로덱스트린(β-CD)을 생성합니다. CD는 수용성이 높은 분자로 지질을 공동 내에 캡슐화할 수 있어 세포막으로의 이동을 용이하게 합니다6. 베타-사이클로덱스트린(beta-cyclodextrins)은 막에서 지질을 추가하고 제거하는 데 광범위하게 사용되어 왔다7; 그러나 더 큰 구멍은 콜레스테롤 또는 인지질에 대한 특이성이 부족합니다8. 대조적으로, 캐비티가 더 작은 알파-시클로덱스트린은 스테롤보다 지질 분자를 결합하는 데 더 큰 선택성을 나타냅니다. 구체적으로, 메틸-α-시클로덱스트린(메틸-α-CDs)은 스테롤과 상호 작용하지 않으며 세포막의 콜레스테롤 조성을 변경하지 않고 인지질과 스핑고미엘린을 교환하는 데 효과적으로 사용되었습니다 8,9.

이 원고에서는 메틸-α-CD(MαCD)를 사용하여 세포막의 바깥쪽 첨판에 있는 지질을 지질 뗏목 형성을 촉진하거나 방해하는 특성을 가진 외인성 지질과 교환하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 교환은 인슐린 수용체 활성에 대한 지질 뗏목의 영향을 조사하는 데 사용됩니다. 이 시연은 인슐린 수용체(IR)를 안정적으로 과발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주의 원형질막에서 액체 정렬(Lo) 도메인 형성에 영향을 미치는 인지질 및 스핑고미엘린의 도입에 초점을 맞출 것입니다10. CHO IR 세포의 지질 교환 정도는 고성능 박막 크로마토그래피(HP-TLC)를 통해 평가되며, 인슐린 수용체 활성의 변화는 지질 교환 후 인슐린 자극 후 웨스턴 블롯 분석을 통해 정량화됩니다.

프로토콜

1. 메틸-α-CD 용액의 제조

  1. 유리병에 20mL의 MαCD 분말~10g에 인산염 완충 식염수(PBS) 20mL를 첨가합니다. 따뜻한 수조(45°C)에서 배양하여 용해하고 잘 녹을 때까지 가끔 저어줍니다.
    알림: 용액은 불용성 CD 종으로 인해 여전히 흐릴 수 있습니다.
  2. 용액을 0.22μm 주사기 필터에 통과시킵니다. 해결책이 명확해질 것입니다.
  3. 굴절계를 사용하여 MαCD의 정확한 농도를 측정합니다.
    1. 굴절계의 샘플 영역에 10μL의 샘플을 놓고 흰색 백열 전구를 사용하여 조명을 비춘 다음 용액의 굴절률을 기록합니다.
    2. 다음 방정식을 사용하여 MαCD 농도를 계산합니다.
      RI = (1.49 x 10 x C) + 1.33
      여기서 RI = 굴절률, C = MαCD 농도(mM). 이 방정식은 중량 분석을 통해 얻거나 알려진 부피에 용해된 MαCD의 알려진 중량의 굴절률을 측정했습니다.
  4. 뚜껑이 있는 유리병을 닫고 뚜껑을 투명 필름으로 감싸 증발을 방지합니다. 4 °C에서 보관하십시오.

2. 다층 소포(MLV)의 준비

  1. 클로로포름에 용해된 원하는 외인성 지질의 원액을 20mM - 50mM의 농도로 유지하고 -20°C 이하에서 보관하여 용매 증발을 최소화합니다.
    참고: 표 1 의 모든 지질은 클로로포름 스톡에 완전히 용해될 수 있습니다. 그러나 대체 지질이 완전히 용해되려면 1:1 클로로포름: 메탄올이 필요할 수 있습니다.
  2. 유리 팁이 있는 간접 변위 피펫을 사용하여 지질 스톡을 붕규산염 튜브에 분취합니다. 또는 유리 마이크로 주사기를 사용할 수 있습니다.
  3. 모든 명백한 클로로포름이 증발할 때까지N2 가스의 흐름 아래에서 약 50°C의 낮은 설정에서 가열 블록의 건조 지질 분취액.
  4. 튜브를 진공 챔버에 넣고 1시간 동안 고진공(200mTorr 미만)에 노출시켜 건조된 지질에서 잔류 용매를 제거합니다.
  5. 건조 지질 필름에 무혈청 Ham의 F-12 배지를 첨가하여 최종 농도 20mM에 도달합니다. 뚜껑이나 테프론 테이프로 덮고 70°C 수조에서 5분 동안 가열합니다.
  6. 지질을 현탁하고 MLV를 형성하는 와류. 이제 미디어가 흐리게 표시되어야 합니다.
    참고: 일부 포화 지질은 와류만으로는 완전히 부유하지 않을 수 있으며 필름이 더 이상 보이지 않을 때까지 위아래로 피펫팅하여 부유해야 할 수 있습니다.
    1. 전체 부피를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. MLV는 4°C에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다.

3. 지질 교환 매체의 제조

  1. 표 1에 나와 있는 최종 지질 농도에 준비된 MLV와 함께 MαCD 스톡을 최종 농도 40mM에 추가합니다.
    참고: 4°C에서 보관된 MLV를 사용하는 경우 튜브 바닥에 침전됩니다. 실온으로 예열하고 튜브를 튕기거나 교반하여 다시 부유하게 만듭니다.
    1. 표 1에 따라 37°C 또는 55°C 수조에서 30분 동안 배양하여 MαCD에 지질을 로드합니다. 선택한 온도는 선택한 지질의 겔-액체 상 융점보다 높아야 합니다. 미디어는 흐린 상태에서 맑은 상태로 바뀔 것입니다.
    2. 지질 교환 매체를 30-60분 동안 실온으로 식힙니다.

4. 세포의 지질 교환 처리

  1. 10% 소 태아 혈청(FBS), 300μg/mL L-글루타민, 100μg/mL 비필수 아미노산, 50μg/mL G418, 2μM 메토트렉세이트 및 1x 항생제-항진균제가 보충된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM, 4.5g/L 포도당)에서 CHO IR 세포를 37°C 및 5% CO2 에서 성장시킵니다.
    1. 60mm 플레이트에 1.5 x 106 세포를 파종하고 80%-90% 융합될 때까지 성장합니다.
    2. PBS 1mL를 첨가한 다음 흡인하여 세포를 3x 세척합니다. 혈청이 없는 Ham의 F12 배지 2mL에서 하룻밤 동안 세포를 굶깁니다.
  2. PBS 1mL로 세포를 3배 세척합니다. 준비된 교환 배지 또는 무혈청 배지 1mL를 대조군으로 세포에 추가하고 실온(25°C -27°C)에서 1시간 동안 배양합니다. 교환 매체에 균일하게 노출되도록 15분마다 세포를 소용돌이칩니다.
    1. PBS 1mL로 세포를 3배 세척합니다. 각 플레이트는 5단계에서 지질 추출을 위해 또는 7단계에서 IR 자가인산화를 위해 이후에 처리할 수 있습니다.

5. 세포 배양 플레이트에서 지질 추출

  1. PBS를 완전히 제거하고 플레이트를 45분 동안 또는 완전히 마를 때까지 10° 각도로 설정하고 바닥을 따라 쌓일 수 있는 버퍼를 제거합니다.
  2. 건조된 세포에 3:2 (v:v) 헥산: 이소프로판올 용액 1mL를 추가하고 실온의 셰이커에서 10분 동안 배양합니다.
  3. 용액을 붕규산염 튜브로 옮깁니다. 테프론 테이프로 덮고 -20 °C에서 보관하십시오.
  4. 500μL의 1N NaOH를 첨가하고 실온에서 10분 동안 진탕하여 나머지 세포 파편을 용해합니다.
    1. Bradford Assay와 같은 단백질 정량 분석에서 이 용액을 사용하여 각 샘플의 단백질 농도를 측정할 수 있습니다. 이러한 농도 값은 모든 샘플에서 동일한 지질 로딩을 위해 HP-TLC 플레이트에서 지질 추출물의 로딩 부피를 정규화하는 데 사용할 수 있습니다.

6. HP-TLC를 통한 교환 효율 확인

  1. 65:25:5 (v:v:v) 클로로포름:메탄올:30% (v/v) 수산화암모늄 100mL를 만들어 유리 TLC 탱크에 붓습니다. 단단히 덮고 증기가 최소 1 시간 동안 평형을 이루도록하십시오.
  2. 모든 겉보기 유기 용매가 증발할 때까지N2 가스의 흐름 아래에서 낮은 설정의 가열 블록에서 건조 지질 추출물 샘플을 추출합니다.
  3. 지질 필름을 50μL의 1:1(v:v) 클로로포름: 메탄올에 용해시킵니다.
  4. 10 μL Hamilton 주사기를 사용하여 실리카 HP-TLC 플레이트에 1cm 띠로 1-10 μL의 시료를 로드합니다. 10cm 플레이트에 최대 20개의 밴드를 로드합니다. 정규화된 값을 사용하여 모든 샘플에 걸쳐 동일한 양의 지질을 로드하는 데 필요한 부피를 결정합니다.
    참고: 각 샘플을 로드하기 전에 플레이트를 중간 높이로 설정된 핫 플레이트에 올려 플레이트를 활성화해야 합니다.
  5. 플레이트를 TLC 탱크에 똑바로 세우고 인지질 종의 분리를 보장하기 위해 용매 전면이 8cm 이동하도록 합니다.
  6. 접시를 10분 동안 말리십시오. 3%(w/v) 아세트산 구리와 8%(v/v) 인산의 수용액을 분무합니다.
    1. 접시를 실온 또는 히트 건으로 30분 동안 건조시킵니다. 접시는 반투명 파란색에서 불투명 흰색으로 바뀌어야 합니다.
  7. 180 °C-200 °C 오븐에서 5-10분 동안 또는 검은색 지질 띠가 검출될 때까지 숯 플레이트를 굽습니다.

7. autophosphorylation assay와 서쪽 블롯을 가진 수용체 활성화 확인

  1. 500μL의 100nM 인슐린이 함유된 세포를 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  2. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 씻어내고 얼음 위에 세포를 올려 자극을 멈춥니다. 즉시 얼음처럼 차가운 PBS 1mL를 세포에 첨가하고 세포 스크레이퍼로 수확합니다. 3000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 펠렛 셀.
  3. 100-200 μL의 완전한 RIPA 용해 완충액(50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1%(v/v) Triton X-100, 1%(w/v) sodium deoxycholate, 1 mM 활성 sodium orthovanadate, 10 μg/mL 아프로티닌, 10 μg/mL 류펩틴)을 얼음 위의 세포 펠렛에 추가합니다. 피펫을 위아래로 30x-40x 용해합니다.
  4. 얼음 위에서 10분 동안 용해물을 배양합니다. 4°C에서 16,000 x g 로 10분 동안 회전하고 상층액을 수집하여 세포 파편의 용해물을 제거합니다. Bradford 분석으로 단백질 농도를 측정하기 위해 약 20μL의 용해물을 예약합니다.
  5. 용해물을 5x Laemmli 완충액 (350 mM Tris HCl pH 6.8, 30 % v / v 글리세롤, 10 % w / v SDS, 25 % v / v β-메르 캅토 에탄올, 0.002g 브로 모페놀 블루)과 결합하고 95 ° C에서 5 분 동안 끓입니다. 첨가된 완충액의 부피는 1x Laemmli 완충액의 최종 농도를 달성하기에 충분해야 합니다.
  6. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 통해 용해물을 실행합니다.
    1. 분자량 마커와 함께 모든 샘플에 대해 동일한 질량의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 로드합니다. 100-150kDa 범위에서 잘 분해될 때까지 실행 버퍼(2.5mM Tris pH 8, 19.2mM 글리신, 0.01%(w/v) SDS)에서 100V-250V에서 실행합니다.
  7. 100V 및 4°C에서 1시간 동안 전달 버퍼(2.5mM Tris pH 8, 19.2mM 글리신)의 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 이동합니다.
  8. TBST(50mM Tris pH 8, 150mM NaCl, 0.1%(v/v) Tween 20)의 5% BSA 용액에서 실온에서 30분 동안 PVDF 멤브레인을 차단합니다.
  9. pYpY IR 항체 또는 IR-β 항체를 TBST의 5% BSA 용액에 1:1000 농도로 넣고 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    참고: pYpY IR 항체는 인산화된 티로신 1162 및 1163을 특이적으로 인식하고 수용체의 자가인산화를 나타내는 역할을 합니다. IR-β 항체는 인산화 상태에 관계없이 수용체의 베타 서브유닛을 무차별적으로 인식하고 수용체의 전체 수준을 나타내는 역할을 합니다.
  10. 실온에서 TBST로 3회 세탁합니다. TBST의 1% BSA 용액에 1:3000 농도의 α Rabbit-HRP 항체를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  11. 실온에서 TBST로 3회 세탁합니다. 향상된 화학발광(ECL) 기판으로 1분 동안 배양하고 필름을 이미지화합니다.

결과

교환 후 세포 지질 조성의 관찰 가능한 변화를 입증하기 위해 뇌 SM(bSM) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 교환 후 CHO IR 세포에 대해 HP-TLC를 수행했습니다(그림 1). bSM과 같은 스핑고미엘린이 교환에 사용되는 경우, SM 밴드 강도의 증가와 함께 처리되지 않은 대조군에 비해 PC 밴드 강도의 감소가 명백합니다. 반대로, DOPC와 같은 포스파티...

토론

세포막에 지질 뗏목이 존재한다는 개념화가 이루어진 이후, 세포에서 지질 뗏목을 시각화하고 지질과 수용체 연관성을 연구하려는 수많은 시도가 있었습니다. 세포에서 현미경 검사법(microscopy)11과 관련된 실험은 세포12에서 정렬된 지질 도메인의 국소화를 시각적으로 연구하기 위해 형광 표지된 바이오마커(biomarkers, 일반적으로 뗏목?...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

자금은 NIH 보조금 GM 122493에서 제공했습니다. CHO IR 세포는 Jonathan Whittaker 박사(Case Western Reserve University)의 친절한 선물이었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)Avanti Polar Lipids850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids850457
Anti-insulin receptor β antibodyCell Signaling TechnologyCST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibodyR&D Systems Inc.AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)Thermo Fisher Scientific14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)Avanti Polar Lipids860062
Egg sphingomyelin (eSM)Avanti Polar Lipids860061
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-016-CV
G418 disulfate saltSigma AldrichA1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)Thermo Fisher Scientific11965092
Gibco ham’s F12 mediaThermo Fisher Scientific11765054
Gibco L-glutamineThermo Fisher Scientific25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)MerckHP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF MembraneMilliporeIPVH00010
MethotrexateSigma Aldrich454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)AraChemCDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermo Fisher Scientific32106
Sodium orthovanadate, ActivatedSigma Aldrich5.08605

참고문헌

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