JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описан способ использования циклодекстрина для опосредования обмена между липидами плазматической мембраны с экзогенными липидами. Этот метод может быть объединен с экспериментами по изучению трансмембранных белков, которые ведут себя иначе в липидных рафт-средах, чем в нерафт-подобных средах.

Аннотация

Липидные рафты представляют собой динамические, упорядоченные домены в плазматической мембране, часто образующиеся во время кластеризации мембранных белков и передачи сигналов. Липидная идентичность наружного листка определяет склонность мембраны к образованию липидных рафтов. Преходящий характер липидных рафтов затрудняет их изучение в живых клетках. Таким образом, методы, которые добавляют или удаляют образующие рафты липиды на внешнем листке живых клеток, облегчают изучение характеристик рафтов, таких как их влияние на мембранные белки. В экспериментах по обмену липидов, разработанных в нашей лаборатории, используются циклодекстрины, нагруженные липидами, для удаления и добавления экзогенных фосфолипидов для изменения липидного состава плазматической мембраны. Замена мембраны на плот или липид, не образующий рафт, может помочь в изучении влияния на трансмембранную активность белка. Здесь мы опишем метод липидного обмена на наружной створке плазматической мембраны с использованием циклодекстрина, нагруженного липидами. Мы демонстрируем приготовление обменных сред и последующую обработку прикрепленных клеток млекопитающих. Мы также покажем, как измерить эффективность обмена с помощью HP-TLC. Этот протокол обеспечивает почти полную замену наружной створки экзогенными липидами без изменения клеточной жизнеспособности, что позволяет проводить дальнейшие эксперименты на модифицированных интактных плазматических мембранах.

Введение

Плазматическая мембрана состоит из липидного бислоя, обогащенного различными мембранными белками, включая трансмембранные рецепторы и ионные каналы. Липидные домены в мембране были выяснены с помощью растворимых в детергентных средствах и нерастворимых областей, идентифицированных в экспериментах по фракционированию мембран, устойчивых к детергентам (DRM)1. Нерастворимые фракции характеризовались тем, что они были обогащены холестерином, плотно упакованными сфингомиелинами и насыщенными фосфолипидами, демонстрируя более высокие температуры плавления, в отличие от растворимых фракций, которые преимущественно состоят из более низкой температуры плавления и свободно упакованных ненасыщенных фосфолипидов. Плотно упакованные области называются жидкоупорядоченными (Lo) липидными доменами, или липидными рафтами, в то время как более свободно организованные жидкостно-неупорядоченные (Ld) липидные домены являются не-плотными областями плазматической мембраны 2,3. Известно, что области липидных рафтов облегчают сигнальные процессы, при этом данные указывают на то, что активный рецептор инсулина связан с этими плотами 4,5. Тем не менее, из-за динамической природы клеточной мембраны и в целом небольшого размера доменов, прямая визуализация присутствия плотов в живых клетках представляет собой значительную проблему. В этом контексте мы представляем метод исследования влияния липидных рафтов на рецептор инсулина с помощью методов липидного обмена.

Циклодекстрины (ХД) образуются связанными мономерами глюкозы, которые создают кольцеобразную структуру с центральной полостью. Размер этой полости определяется количеством единиц глюкозы: шесть единиц образуют альфа-циклодекстрин (α-CD), в то время как семь единиц создают бета-циклодекстрины (β-CD). CD представляют собой высокорастворимые в воде молекулы, способные инкапсулировать липиды в своей полости, тем самым облегчая их транспортировку к клеточной мембране6. Бета-циклодекстрины широко используются для добавления и удаления липидов из мембран7; Однако его большая полость не обладает специфичностью к холестерину или фосфолипидам8. Напротив, альфа-циклодекстрины, с их меньшей полостью, демонстрируют большую селективность в связывании молекул липидов со стеринами. В частности, метил-α-циклодекстрин (метил-α-CD) не взаимодействует со стеролами и эффективно используется для обмена фосфолипидов и сфингомиелинов без изменения холестеринового состава клеточной мембраны.

В этой рукописи мы предоставляем подробный протокол использования метил-α-CD (MαCD) для обмена липидов во внешнем листке клеточной мембраны с экзогенными липидами, которые обладают свойствами либо способствовать, либо нарушать образование липидных рафтов. Этот обмен используется для исследования влияния липидных рафтов на активность рецепторов инсулина. Демонстрация будет сосредоточена на введении фосфолипида и сфингомиелина, влияющих на образование жидкостно-упорядоченных (Lo) доменов в плазматической мембране клеточных линий яичников китайского хомяка (CHO), стабильно сверхэкспрессирующих рецептор инсулина (IR)10. Степень липидного обмена в клетках CHO IR будет оцениваться с помощью высокоэффективной тонкослойной хроматографии (HP-TLC), в то время как изменения активности рецепторов инсулина будут количественно оцениваться с помощью вестерн-блоттинга после стимуляции инсулина после липидного обмена.

протокол

1. Приготовление раствора метил-α-CD

  1. Добавьте 20 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) к ~10 г порошка MαCD в стеклянный флакон. Инкубировать на теплой водяной бане (45 °C) до полного растворения, периодически помешивая, пока он хорошо не растворится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может оставаться мутным из-за нерастворимых видов CD.
  2. Пропустите раствор через шприцевой фильтр 0,22 мкм. Решение станет ясным.
  3. Используйте рефрактометр для определения точной концентрации MαCD.
    1. Поместите 10 мкл образца на образец рефрактометра, осветите его с помощью белой лампы накаливания и запишите показатель преломления раствора.
    2. Рассчитайте концентрацию MαCD с помощью уравнения
      RI = (1,49 x 10 x C) + 1,33
      где RI = показатель преломления, C = концентрация MαCD (мМ). Уравнение было получено с помощью гравиметрического анализа, или измерения показателя преломления известной массы MαCD, растворенного в известном объеме.
  4. Закройте стеклянную бутылку крышкой и заверните крышку в прозрачную пленку, чтобы предотвратить испарение. Хранить при температуре 4 °C.

2. Подготовка многопластинчатых везикул (MLV)

  1. Храните в исходных растворах желаемых экзогенных липидов, растворенных в хлороформе, в концентрации от 20 мМ до 50 мМ и храните при температуре -20 °C или ниже, чтобы свести к минимуму испарение растворителя.
    Примечание: Все липиды в таблице 1 могут быть полностью растворены в запасах хлороформа. Тем не менее, возможно, что для полного растворения альтернативных липидов может потребоваться хлороформ: метанол в соотношении 1:1.
  2. Аликвотируйте липидный запас в боросиликатные пробирки с помощью пипетки прямого вытеснения со стеклянным наконечником. В качестве альтернативы можно использовать стеклянный микрошприц.
  3. Высушите аликвоту липидов на нагревательном блоке при низкой температуре около 50 °C под потоком газаN2 до тех пор, пока весь видимый хлороформ не испарится.
  4. Удалите остатки растворителя из высохших липидов, поместив пробирку в вакуумную камеру и подвергнув ее воздействию высокого вакуума (менее 200 мТорр) в течение 1 часа.
  5. Добавьте бессывороточный фильтрующий материал Ham's F-12 в сухую липидную пленку до конечной концентрации 20 мМ. Накрыть крышкой или тефлоновой лентой и нагреть на водяной бане 70 °C в течение 5 минут.
  6. Vortex для суспензии липидов и образования MLV. Теперь носители должны выглядеть мутными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые насыщенные липиды могут не полностью суспендироваться только за счет вортексинга, и их может потребоваться суспендировать путем пипетирования вверх и вниз до тех пор, пока пленка не станет видимой.
    1. Переложите весь объем в микроцентрифужную пробирку. MLV могут храниться до 3 дней при температуре 4 °C.

3. Приготовление липидообменных сред

  1. Добавьте исходный запас MαCD до конечной концентрации 40 мМ, а подготовленные MLV — до конечной концентрации липидов, указанной в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании MLV, хранящихся при температуре 4 °C, они будут оседать на дне пробирки. Нагрейте до комнатной температуры и убедитесь, что они снова подвешены, щелкая или перемешивая трубку.
    1. Загрузите липиды в MαCD путем инкубации в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 °C или 55 °C в соответствии с таблицей 1. Выбранная температура должна быть выше точки плавления гелеобразно-жидкой фазы выбранного липида. Среда должна переходить от облачной к ясной.
    2. Дайте липидобменной среде остыть до комнатной температуры в течение 30-60 минут.

4. Липидобменное лечение клеток

  1. Выращивайте клетки CHO IR при 37 °C и 5 %CO2 в модифицированной среде Eagle's Medium от Dulbecco (DMEM, 4,5 г/л глюкозы) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 300 мкг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл заменимых аминокислот, 50 мкг/мл G418, 2 мкм метотрексата и 1x антибиотика-антимикотика.
    1. Посейте семена 1,5 х 10по 6 клеток в пластины по 60 мм и выращивайте до тех пор, пока они не сливатся на 80%-90%.
    2. Промойте ячейки 3 раза, добавив 1 мл PBS, а затем аспирируйте. Заморочьте клетки на ночь в 2 мл бессывороточной среды Ham's F12.
  2. Промойте ячейки 3 раза 1 мл PBS. Добавьте в клетки 1 мл подготовленной обменной среды или бессывороточной среды в качестве контроля и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре (25 °C -27 °C). Вкручивайте клетки каждые 15 минут, чтобы обеспечить равномерное воздействие обменных сред.
    1. Промойте ячейки 3 раза 1 мл PBS. Каждая пластина может быть впоследствии обработана для экстракции липидов на стадии 5 или для ИК-аутофосфорилирования на стадии 7.

5. Экстракция липидов на планшете для культивирования клеток

  1. Полностью удалите PBS и установите пластину под углом 45° на 10 минут или до полного высыхания, удалив буфер, который может скапливаться на дне.
  2. Добавьте 1 мл раствора гексана 3:2 (v:v) в высушенные клетки и инкубируйте в течение 10 минут в шейкере при комнатной температуре.
  3. Переложите раствор в боросиликатную трубку. Накрыть тефлоновой лентой и хранить при температуре -20 °C.
  4. Растворите оставшийся клеточный мусор, добавив 500 мкл 1N NaOH и встряхивая в течение 10 минут при комнатной температуре.
    1. Используйте этот раствор в количественном анализе белка, таком как анализ Брэдфорда, чтобы определить концентрацию белка в каждом образце. Эти значения концентрации могут быть использованы для нормализации объемов загрузки липидных экстрактов на планшетах HP-TLC для обеспечения равной липидной нагрузки во всех образцах.

6. Проверка эффективности обмена с помощью HP-TLC

  1. Приготовьте 100 мл 65:25:5 (v:v:v) хлороформа:метанола:30% (v/v) гидроксида аммония и налейте его в стеклянный резервуар TLC. Плотно накройте крышкой и дайте пару сбалансироваться не менее 1 часа.
  2. Высушите образец липидного экстракта на нагревательном блоке при низкой температуре под потоком газа N2 до тех пор, пока весь кажущийся органический растворитель не испарится.
  3. Растворите липидную пленку в 50 мкл 1:1 (v:v) хлороформа: метанола.
  4. С помощью шприца Hamilton объемом 10 мкл загрузите 1-10 мкл образца полосами по 1 см на пластину HP-TLC из диоксида кремния. Нагрузите максимум 10 лент на плиту диаметром 20 см. Используйте нормализованные значения для определения объемов, необходимых для загрузки равного количества липидов во все образцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед загрузкой каждого образца пластину следует активировать, поместив ее на горячую пластину в средне-высокую температуру.
  5. Поместите пластину вертикально в резервуар TLC и дайте фронту растворителя переместиться на 8 см, чтобы обеспечить отделение фосфолипидных веществ.
  6. Дайте тарелке обсохнуть в течение 10 минут. Опрыскать водным раствором 3% (v/v) ацетата меди и 8% (v/v) фосфорной кислоты.
    1. Дайте тарелке высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре или с помощью тепловой пушки. Пластина должна превратиться из полупрозрачного синего в непрозрачный белый.
  7. Обуглите в духовке при температуре 180-200 °C в течение 5-10 минут или до тех пор, пока черные липидные полосы не станут заметными.

7. Проверка активации рецепторов с помощью анализа аутофосфорилирования и вестерн-блоттинга

  1. Инкубировать клетки с 500 мкл 100 нМ инсулина в бессывороточной среде при комнатной температуре в течение 5 минут.
  2. Промойте клетки ледяным PBS и положите клетки на лед, чтобы остановить стимуляцию. Немедленно добавьте 1 мл ледяного PBS в клетки и соберите с помощью скребка для клеток. Пеллетные ячейки при 3000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  3. Добавьте 100-200 мкл полного буфера для лизиса RIPA (50 мМ Tris pH 8, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (w/v) дезоксихолата натрия, 1 мМ активированный антованадат натрия, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина) в клеточную гранулу на льду. Пипеткой вверх и вниз 30x-40x для лизиса.
  4. Инкубировать лизат на льду в течение 10 минут. Очистите лизат клеточного мусора путем вращения при 16 000 x g в течение 10 мин при 4 °C и сбора надосадочной жидкости. Резервируйте около 20 мкл лизата для определения концентрации белка с помощью анализа Брэдфорда.
  5. Смешайте лизат с 5x буфером Laemmli (350 мМ Tris HCl pH 6,8, 30% v/v глицерина, 10% w/v SDS, 25% v/v β-меркаптоэтанола, 0,002 г бромфенолового синего) и кипятите при 95 °C в течение 5 минут. Объем добавляемого буфера должен быть достаточным для достижения конечной концентрации 1x буфера Laemmli.
  6. Запустите лизаты с помощью электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE).
    1. Загрузите одинаковую массу белка для всех образцов вместе с маркером молекулярной массы в гель SDS-PAGE. Работать при напряжении 100–150 В в работающем буфере (2,5 мМ при pH 8, 19,2 мМ глицина, 0,01% (по объему) SDS) до хорошего разрешения в диапазоне 100-250 кДа.
  7. Перенесите на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) в буфере для переноса (2,5 мМ Tris pH 8, 19,2 мМ глицин) в течение 1 ч при 100 В и 4 °C.
  8. Заблокируйте мембрану PVDF на 30 мин при комнатной температуре в 5% растворе BSA в TBST (50 мМ Tris pH 8, 150 мМ NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20).
  9. Инкубировать с ИК-антителом pYpY или ИК-β антителом в концентрации 1:1000 в 5% растворе БСА в TBST в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
    Антитело pYpY IR специфически распознает фосфорилированные тирозины 1162 и 1163 и служит для указания на аутофосфорилирование рецептора. Антитело IR-β распознает бета-субъединицу рецептора без разбора, независимо от состояния фосфорилирования, и служит для индикации глобальных уровней рецептора.
  10. Постирайте 3 раза с TBST при комнатной температуре. Инкубировать с антителом Rabbit-HRP α концентрации 1:3000 в 1% растворе BSA в TBST в течение 30 минут при комнатной температуре.
  11. Постирайте 3 раза с TBST при комнатной температуре. Инкубируйте с улучшенным хемилюминесцентным (ECL) субстратом в течение 1 минуты и смойте пленку.

Результаты

Чтобы продемонстрировать наблюдаемые изменения в клеточном липидном составе после обмена, мы проводили HP-TLC на клетках CHO IR после обмена SM мозга (bSM) и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DOPC) (рис. 1). В тех случаях, когда для обмена используются сфингомиели...

Обсуждение

С момента концептуализации существования липидных рафтов в клеточной мембране предпринимались многочисленные попытки визуализировать их в клетках и изучить липидную и рецепторную ассоциацию. В экспериментах с использованием микроскопии11 в клетках ис...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Финансирование было предоставлено грантом NIH GM 122493. Клетки CHO IR были любезным подарком от доктора Джонатана Уиттакера (Case Western Reserve University).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)Avanti Polar Lipids850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids850457
Anti-insulin receptor β antibodyCell Signaling TechnologyCST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibodyR&D Systems Inc.AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)Thermo Fisher Scientific14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)Avanti Polar Lipids860062
Egg sphingomyelin (eSM)Avanti Polar Lipids860061
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-016-CV
G418 disulfate saltSigma AldrichA1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)Thermo Fisher Scientific11965092
Gibco ham’s F12 mediaThermo Fisher Scientific11765054
Gibco L-glutamineThermo Fisher Scientific25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)MerckHP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF MembraneMilliporeIPVH00010
MethotrexateSigma Aldrich454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)AraChemCDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermo Fisher Scientific32106
Sodium orthovanadate, ActivatedSigma Aldrich5.08605

Ссылки

  1. Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Brown, D. A. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Physiology. 21, 430-439 (2006).
  3. Schroeder, R., London, E., Brown, D. Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).
  4. Suresh, P., Miller, W. T., London, E. Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains. J Biol Chem. 297 (3), 101010 (2021).
  5. Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).
  6. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).
  7. Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes. Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).
  8. Suresh, P., London, E. Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774 (2022).
  9. Li, G., et al. Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).
  10. Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).
  11. Gaus, K., et al. Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).
  12. Klymchenko, S., Kreder, R. Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells. Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).
  13. Pike, L. J. Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story. Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).
  14. Brown, D. A., London, E. Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes. Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).
  15. Lin, Q., London, E. Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry. PLoS One. 9 (1), e87903 (2014).
  16. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  17. Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. How lipid flippases can modulate membrane structure. Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).
  18. Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis. J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).
  19. Li, G., et al. Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity. PLoS One. 14 (10), e0223572 (2019).
  20. Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes. FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).
  21. Suresh, P., London, E. MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity. Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

HP TLC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены