Saggio di scambio lipidico in cellule viventi

Riepilogo

Descriviamo un metodo per l'utilizzo della ciclodestrina per mediare lo scambio tra i lipidi della membrana plasmatica con i lipidi esogeni. Questa tecnica può essere abbinata a esperimenti che studiano le proteine transmembrana, che si comportano in modo diverso in ambienti lipidici simili a zattere rispetto agli ambienti non simili a zattere.

Abstract

I raft lipidici sono domini dinamici e ordinati nella membrana plasmatica spesso formati durante il raggruppamento e la segnalazione delle proteine di membrana. L'identità lipidica del lembo esterno guida la propensione della membrana a formare zattere lipidiche. La natura transitoria dei raft lipidici rende difficile lo studio nelle cellule viventi. Pertanto, i metodi che aggiungono o rimuovono i lipidi che formano zattere sul lembo esterno delle cellule viventi facilitano lo studio delle caratteristiche delle zattere, come i loro effetti sulle proteine di membrana. Gli esperimenti di scambio lipidico sviluppati nel nostro laboratorio utilizzano ciclodestrine caricate con lipidi per rimuovere e aggiungere fosfolipidi esogeni per modificare la costituzione lipidica della membrana plasmatica. La sostituzione della membrana con un lipide a zattera o non formante zattera può aiutare a studiare gli effetti sull'attività proteica transmembrana. Qui, descriviamo un metodo per lo scambio lipidico sul lembo esterno della membrana plasmatica utilizzando ciclodestrine caricate con lipidi. Dimostriamo la preparazione dei mezzi di scambio e il successivo trattamento delle cellule di mammifero attaccate. Mostriamo anche come misurare l'efficienza dello scambio utilizzando HP-TLC. Questo protocollo consente di sostituire quasi completamente il lembo esterno con lipidi esogeni senza alterare la vitalità cellulare, consentendo ulteriori sperimentazioni su membrane plasmatiche intatte modificate.

Introduzione

La membrana plasmatica è composta da un doppio strato lipidico arricchito con varie proteine di membrana, inclusi recettori transmembrana e canali ionici. I domini lipidici all'interno della membrana sono stati chiariti attraverso regioni solubili e insolubili in detergenti identificate in esperimenti di frazionamento a membrana resistente ai detergenti (DRM)¹. Le frazioni insolubili erano caratterizzate dall'essere arricchite in colesterolo, sfingomieline strettamente impacchettate e fosfolipidi saturi, esibendo punti di fusione più elevati, in contrasto con le frazioni solubili che consistono prevalentemente di temperature di fusione più basse e fosfolipidi insaturi debolmente impacchettati. Le regioni strettamente impacchettate sono indicate come domini lipidici ordinati ai liquidi (Lo), o zattere lipidiche, mentre i domini lipidici disordinati dai liquidi (Ld) più vagamente organizzati sono le regioni non zattere della membrana plasmatica ^2,3. È noto che le regioni delle zattere lipidiche facilitano i processi di segnalazione, con prove che indicano che il recettore attivo dell'insulina si associa a queste zattere ^4,5. Tuttavia, a causa della natura dinamica della membrana cellulare e delle dimensioni generalmente ridotte dei domini, la visualizzazione diretta della presenza di zattere nelle cellule vive presenta sfide significative. In questo contesto, presentiamo un metodo per studiare l'impatto dei lipid rafts sul recettore dell'insulina attraverso tecniche di scambio lipidico.

Le ciclodestrine (CD) sono formate da monomeri di glucosio collegati che creano una struttura ad anello con una cavità centrale. La dimensione di questa cavità è determinata dal numero di unità di glucosio: sei unità formano l'alfa-ciclodestrina (α-CD), mentre sette unità creano beta-ciclodestrine (β-CD). I CD sono molecole altamente solubili in acqua in grado di incapsulare i lipidi all'interno della loro cavità, facilitandone così il trasporto alla membrana cellulare⁶. Le beta-ciclodestrine sono state ampiamente utilizzate per aggiungere e rimuovere lipidi dalle membrane⁷; Tuttavia, la sua cavità più grande manca di specificità per il colesterolo o i fosfolipidi⁸. Al contrario, le alfa-ciclodestrine, con la loro cavità più piccola, mostrano una maggiore selettività nel legare le molecole lipidiche rispetto agli steroli. In particolare, la metil-α-ciclodestrina (metil-α-CDs) non interagisce con gli steroli ed è stata efficacemente utilizzata per scambiare fosfolipidi e sfingomieline senza alterare la composizione del colesterolo della membrana cellulare ^8,9.

In questo manoscritto, forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di metil-α-CD (MαCD) per scambiare lipidi nel foglietto esterno della membrana cellulare con lipidi esogeni che hanno proprietà che promuovono o interrompono la formazione di zattere lipidiche. Questo scambio viene utilizzato per studiare l'impatto dei raft lipidici sull'attività del recettore dell'insulina. La dimostrazione si concentrerà sull'introduzione di un fosfolipide e di una sfingomielina che influenzano la formazione di domini ordinati nei liquidi (Lo) nella membrana plasmatica di linee cellulari di ovaio di criceto cinese (CHO) che sovraesprimono stabilmente il recettore dell'insulina (IR)¹⁰. L'entità dello scambio lipidico nelle cellule CHO IR sarà valutata attraverso la cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni (HP-TLC), mentre le variazioni dell'attività del recettore dell'insulina saranno quantificate mediante analisi western blot a seguito di stimolazione insulinica post-scambio lipidico.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione di metil-α-CD

1. Aggiungere 20 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a ~10 g di polvere di MαCD in un flacone di vetro. Incubare a bagnomaria (45 °C) per sciogliere, mescolando di tanto in tanto fino a quando non sarà ben sciolto.
   NOTA: La soluzione potrebbe essere ancora torbida a causa di specie di CD insolubili.
2. Far passare la soluzione attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm. La soluzione diventerà chiara.
3. Utilizzare un rifrattometro per determinare l'esatta concentrazione di MαCD.
   1. Posizionare 10 μl di campione sull'area del campione di un rifrattometro, illuminarlo con una lampadina a incandescenza bianca e registrare l'indice di rifrazione della soluzione.
   2. Calcola la concentrazione di MαCD usando l'equazione
      RI = (1,49 x 10 x C) + 1,33
      dove RI = indice di rifrazione, C = concentrazione di MαCD (mM). L'equazione è stata ottenuta attraverso l'analisi gravimetrica, ovvero la misurazione dell'indice di rifrazione di un peso noto di MαCD disciolto in un volume noto.
4. Chiudere la bottiglia di vetro con un coperchio e avvolgere il coperchio in una pellicola trasparente per evitare l'evaporazione. Conservare a 4 °C.

2. Preparazione di vescicole multilamellari (MLV)

1. Mantenere le soluzioni stock dei lipidi esogeni desiderati disciolti nel cloroformio a concentrazioni comprese tra 20 mM e 50 mM e conservare a -20 °C o inferiori per ridurre al minimo l'evaporazione del solvente.
   NOTA: Tutti i lipidi nella Tabella 1 possono essere completamente disciolti in cloroformio. Tuttavia, è possibile che i lipidi alternativi richiedano il cloroformio 1:1: metanolo per dissolversi completamente.
2. Aliquotare lo stock lipidico in provette di borosilicato utilizzando una pipetta a spostamento positivo con punta di vetro. In alternativa, è possibile utilizzare una microsiringa di vetro.
3. Asciugare l'aliquota lipidica su un blocco riscaldante a una temperatura bassa di circa 50 °C sotto una corrente di gas N₂ fino a quando tutto il cloroformio apparente evapora.
4. Rimuovere il solvente rimanente dal lipide essiccato posizionando la provetta in una camera a vuoto ed esponendola a un vuoto elevato (inferiore a 200 mTorr) per 1 ora.
5. Aggiungere il terreno F-12 Ham's F-12 senza siero al film lipidico secco per raggiungere una concentrazione finale di 20 mM. Coprire con un coperchio o del nastro di teflon e scaldare a bagnomaria a 70 °C per 5 minuti.
6. Vortice per sospendere i lipidi e formare MLV. Il supporto dovrebbe ora apparire nuvoloso.
   NOTA: Alcuni lipidi saturi potrebbero non essere completamente sospesi dal solo vortice e potrebbe essere necessario sospenderli pipettando su e giù fino a quando la pellicola non è più visibile.
   1. Trasferire l'intero volume in una provetta da microcentrifuga. Gli MLV possono essere conservati fino a 3 giorni a 4 °C.

3. Preparazione dei mezzi di scambio lipidico

1. Aggiungere lo stock di MαCD a una concentrazione finale di 40 mM, insieme ai MLV preparati alla concentrazione lipidica finale trovata nella Tabella 1.
   NOTA: Se si utilizzano MLV conservati a 4 °C, verranno depositati sul fondo del tubo. Riscaldare a temperatura ambiente e assicurarsi che siano risospese muovendo o agitando il tubo.
   1. Caricare i lipidi su MαCD incubando per 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 °C o 55 °C secondo la Tabella 1. La temperatura scelta deve essere superiore al punto di fusione della fase gel-liquido del lipide scelto. I media dovrebbero passare da nuvolosi a sereni.
   2. Lasciare raffreddare i terreni di scambio lipidico a temperatura ambiente per 30-60 minuti.

4. Trattamento a scambio lipidico delle cellule

1. Coltivare cellule CHO IR a 37 °C e 5% CO₂ nel terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L di glucosio) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 300 μg/mL di L-glutammina, 100 μg/mL di aminoacidi non essenziali, 50 μg/mL di G418, 2 μM di metotrexato e 1x antibiotico-antimicotico.
   1. Seminare 1,5 x 10⁶ cellule in piastre da 60 mm e crescere fino a quando non sono confluenti all'80%-90%.
   2. Lavare le celle 3 volte aggiungendo 1 mL di PBS e quindi aspirando. Far morire di fame le cellule per una notte in 2 ml di terreno F12 di Ham's senza siero.
2. Lavare le celle 3 volte con 1 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di terreno di scambio preparato o terreno di scambio privo di siero come controllo alle cellule e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (25 °C -27 °C). Agitare le celle ogni 15 minuti per garantire un'esposizione uniforme ai mezzi di scambio.
   1. Lavare le celle 3 volte con 1 mL di PBS. Ogni piastra può essere successivamente lavorata per l'estrazione dei lipidi nella fase 5 o per l'autofosforilazione IR nella fase 7.

5. Estrazione dei lipidi su piastra di coltura cellulare

1. Rimuovere completamente il PBS e impostare la piastra a un angolo di 45° per 10 minuti o fino a completa asciugatura, rimuovendo eventuali tamponi che potrebbero accumularsi lungo il fondo.
2. Aggiungere 1 mL di soluzione di esano: isopropanolo 3:2 (v:v) alle cellule essiccate e incubare per 10 minuti su un agitatore a temperatura ambiente.
3. Trasferire la soluzione in una provetta di borosilicato. Coprire con nastro di teflon e conservare a -20 °C.
4. Sciogliere i detriti cellulari rimanenti aggiungendo 500 μl di NaOH 1N e agitando per 10 minuti a temperatura ambiente.
   1. Utilizzare questa soluzione in un saggio di quantificazione delle proteine come il Bradford Assay per determinare la concentrazione proteica di ciascun campione. Questi valori di concentrazione possono essere utilizzati per normalizzare i volumi di carico degli estratti lipidici su piastre HP-TLC per un carico lipidico uguale in tutti i campioni.

6. Verifica dell'efficienza di scambio con HP-TLC

1. Preparare 100 mL di cloroformio:metanolo:30% (v/v) idrossido di ammonio 65:25:5 (v:v:v) e versarlo in un serbatoio di vetro TLC. Coprire bene e lasciare che il vapore si equilibri per almeno 1 ora.
2. Asciugare il campione di estratto lipidico su un blocco riscaldante a bassa impostazione sotto un flusso di gas N₂ fino a quando tutto il solvente organico apparente evapora.
3. Sciogliere il film lipidico in 50 μl di cloroformio 1:1 (v:v): metanolo.
4. Utilizzare una siringa Hamilton da 10 μl per caricare 1-10 μl di campione in bande di 1 cm su una piastra HP-TLC in silice. Caricare un massimo di 10 bande su una piastra di 20 cm. Utilizzare i valori normalizzati per determinare i volumi necessari per caricare quantità uguali di lipidi su tutti i campioni.
   NOTA: Prima di caricare ogni campione, la piastra deve essere attivata posizionandola su una piastra calda a un'impostazione medio-alta.
5. Posizionare la piastra in posizione verticale nel serbatoio TLC e lasciare che la parte anteriore del solvente si sposti di 8 cm per garantire la separazione delle specie fosfolipidiche.
6. Lasciare asciugare la piastra per 10 minuti. Spruzzare con una soluzione acquosa di acetato rameico al 3% (p/v) e acido fosforico all'8% (v/v).
   1. Lasciare asciugare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente o con una pistola termica. La lastra dovrebbe passare dal blu traslucido al bianco opaco.
7. Carbonizzare in forno a 180 °C-200 °C per 5-10 minuti o fino a quando le bande lipidiche nere diventano rilevabili.

7. Controllo dell'attivazione dei recettori con saggio di autofosforilazione e western blot

1. Incubare le cellule con 500 μL di insulina da 100 nM in terreni privi di siero a temperatura ambiente per 5 minuti.
2. Lavare le cellule con PBS ghiacciato e mettere le cellule sul ghiaccio per fermare la stimolazione. Aggiungere prontamente 1 mL di PBS ghiacciato alle cellule e raccogliere con un raschietto cellulare. Celle a pellet a 3000 x g per 5 min a 4 °C.
3. Aggiungere 100-200 μL di tampone di lisi RIPA completo (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (p/v) desossicolato di sodio, 1 mM di ortovanadato di sodio attivato, 10 μg/mL di aprotinina, 10 μg/mL di leupeptina) al pellet cellulare su ghiaccio. Pipettare su e giù 30x-40x per lisi.
4. Incubare il lisato su ghiaccio per 10 minuti. Eliminare il lisato dai detriti cellulari centrifugando a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliendo il surnatante. Riservare circa 20 μL di lisato per determinare la concentrazione proteica con il saggio Bradford.
5. Combinare il lisato con 5 tamponi Laemmli (350 mM Tris HCl pH 6,8, 30% v/v glicerolo, 10% p/v SDS, 25% v/v β-mercaptoetanolo, 0,002 g di blu di bromofenolo) e far bollire a 95 °C per 5 min. Il volume di tampone aggiunto deve essere sufficiente per raggiungere una concentrazione finale di 1x tampone Laemmli.
6. Far scorrere i lisati attraverso l'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE).
   1. Caricare la stessa massa di proteine per tutti i campioni insieme al marcatore di peso molecolare su un gel SDS-PAGE. Funzionamento a 100 V-150 V in tampone di corsa (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glicina, 0,01% (p/v) SDS) fino a quando non si risolve correttamente nell'intervallo 100-250 kDa.
7. Trasferire su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) in tampone di trasferimento (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glicina) per 1 ora a 100 V e 4 °C.
8. Bloccare la membrana in PVDF per 30 minuti a temperatura ambiente in una soluzione BSA al 5% in TBST (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20).
9. Incubare con l'anticorpo pYpY IR o l'anticorpo IR-β a una concentrazione 1:1000 in una soluzione di BSA al 5% in TBST per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
   NOTA: L'anticorpo pYpY IR riconosce specificamente le tirosine fosforilate 1162 e 1163 e serve a indicare l'autofosforilazione del recettore. L'anticorpo IR-β riconosce la subunità beta del recettore indiscriminatamente, indipendentemente dallo stato di fosforilazione, e serve a indicare i livelli globali del recettore.
10. Lavare 3 volte con TBST a temperatura ambiente. Incubare con α anticorpo Rabbit-HRP a una concentrazione 1:3000 in soluzione di BSA all'1% in TBST per 30 minuti a temperatura ambiente.
11. Lavare 3 volte con TBST a temperatura ambiente. Incubare con un substrato chemiluminescente potenziato (ECL) per 1 minuto e creare un'immagine del film.

Risultati

Per dimostrare il cambiamento osservabile nella composizione lipidica cellulare dopo lo scambio, abbiamo eseguito HP-TLC su cellule CHO IR dopo lo scambio cerebrale SM (bSM) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) (Figura 1). Nei casi in cui le sfingomieline come la bSM vengono utilizzate per lo scambio, è evidente un aumento dell'intensità della banda SM, insieme a una diminuzione dell'intensità della banda PC rispetto al controllo non trattato. A...

Discussione

Dalla concettualizzazione dell'esistenza di zattere lipidiche nella membrana cellulare, ci sono stati numerosi tentativi di visualizzarli nelle cellule e di studiare l'associazione tra lipidi e recettori. Gli esperimenti che coinvolgono la microscopia¹¹ nelle cellule hanno utilizzato biomarcatori marcati in fluorescenza, di solito proteine e lipidi noti per associarsi con i raft, per studiare visivamente la localizzazione dei domini lipidici ordinati nella cellula...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)	Avanti Polar Lipids	850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids	850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457
Anti-insulin receptor β antibody	Cell Signaling Technology	CST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibody	R&D Systems Inc.	AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)	Thermo Fisher Scientific	14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)	Avanti Polar Lipids	860062
Egg sphingomyelin (eSM)	Avanti Polar Lipids	860061
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-016-CV
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Gibco ham’s F12 media	Thermo Fisher Scientific	11765054
Gibco L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)	Merck	HP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF Membrane	Millipore	IPVH00010
Methotrexate	Sigma Aldrich	454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)	AraChem	CDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32106
Sodium orthovanadate, Activated	Sigma Aldrich	5.08605