Ensaio de Troca Lipídica em Células Vivas

Resumo

Descrevemos um método para o uso de ciclodextrina para mediar a troca entre lipídios da membrana plasmática com lipídios exógenos. Essa técnica pode ser combinada com experimentos que estudam proteínas transmembranares, que se comportam de maneira diferente em ambientes semelhantes a jangadas lipídicas do que em ambientes não semelhantes a jangadas.

Resumo

As jangadas lipídicas são domínios dinâmicos e ordenados na membrana plasmática, muitas vezes formados durante o agrupamento e sinalização de proteínas da membrana. A identidade lipídica do folheto externo impulsiona a propensão da membrana a formar jangadas lipídicas. A natureza transitória das jangadas lipídicas dificulta o estudo em células vivas. Portanto, métodos que adicionam ou removem lipídios formadores de jangada no folheto externo das células vivas facilitam o estudo das características das jangadas, como seus efeitos nas proteínas da membrana. Experimentos de troca lipídica desenvolvidos em nosso laboratório utilizam ciclodextrinas carregadas de lipídios para remover e adicionar fosfolipídios exógenos para alterar a constituição lipídica da membrana plasmática. A substituição da membrana por um lipídio não formador de jangada ou não formadora de jangada pode ajudar a estudar os efeitos na atividade da proteína transmembrana. Aqui, descrevemos um método para troca lipídica no folheto externo da membrana plasmática usando ciclodextrina carregada de lipídios. Demonstramos a preparação dos meios de troca e o tratamento subsequente de células de mamíferos aderidas. Também mostramos como medir a eficiência da troca usando o HP-TLC. Este protocolo produz uma substituição quase completa do folheto externo por lipídios exógenos sem alterar a viabilidade celular, permitindo mais experimentos em membranas plasmáticas intactas modificadas.

Introdução

A membrana plasmática é composta por uma bicamada lipídica enriquecida com várias proteínas de membrana, incluindo receptores transmembranares e canais iônicos. Os domínios lipídicos dentro da membrana foram elucidados por meio de regiões solúveis e insolúveis em detergente identificadas em experimentos de fracionamento de membrana resistente a detergentes (DRM)¹. As frações insolúveis foram caracterizadas por serem enriquecidas em colesterol, esfingomielinas compactadas e fosfolipídios saturados, exibindo pontos de fusão mais altos, em contraste com as frações solúveis que consistem predominantemente em temperatura de fusão mais baixa e fosfolipídios insaturados fracamente compactados. As regiões compactas são chamadas de domínios lipídicos ordenados por líquido (Lo), ou jangadas lipídicas, enquanto os domínios lipídicos desordenados líquidos (Ld) mais frouxamente organizados são as regiões não modificadas da membrana plasmática ^2,3. Sabe-se que as regiões da jangada lipídica facilitam os processos de sinalização, com evidências indicando que o receptor ativo de insulina se associa a essas jangadas ^4,5. No entanto, devido à natureza dinâmica da membrana celular e ao tamanho geralmente pequeno dos domínios, visualizar diretamente a presença de jangadas em células vivas apresenta desafios significativos. Nesse contexto, apresentamos um método para investigar o impacto das jangadas lipídicas sobre o receptor de insulina por meio de técnicas de troca lipídica.

As ciclodextrinas (CDs) são formadas por monômeros de glicose ligados que criam uma estrutura em forma de anel com uma cavidade central. O tamanho dessa cavidade é determinado pelo número de unidades de glicose: seis unidades formam alfa-ciclodextrina (α-CD), enquanto sete unidades criam beta-ciclodextrinas (β-CDs). Os CDs são moléculas altamente solúveis em água, capazes de encapsular lipídios dentro de sua cavidade, facilitando seu transporte para a membrana celular⁶. As beta-ciclodextrinas têm sido amplamente utilizadas para adicionar e remover lipídios das membranas⁷; no entanto, sua cavidade maior carece de especificidade para colesterol ou fosfolipídios⁸. Em contraste, as alfa-ciclodextrinas, com sua cavidade menor, exibem maior seletividade na ligação de moléculas lipídicas sobre esteróis. Especificamente, a metil-α-ciclodextrina (metil-α-CDs) não interage com esteróis e tem sido efetivamente usada para trocar fosfolipídios e esfingomielinas sem alterar a composição do colesterol da membrana celular ^8,9.

Neste manuscrito, fornecemos um protocolo detalhado para o uso de metil-α-CDs (MαCD) para trocar lipídios no folheto externo da membrana celular com lipídios exógenos que têm propriedades que promovem ou interrompem a formação de jangadas lipídicas. Essa troca é usada para investigar o impacto das jangadas lipídicas na atividade do receptor de insulina. A demonstração se concentrará na introdução de um fosfolipídio e esfingomielina afetando a formação de domínios ordenados em líquido (Lo) na membrana plasmática de linhagens celulares de ovário de hamster chinês (CHO) superexpressando de forma estável o receptor de insulina (IR) ¹⁰ . A extensão da troca lipídica nas células CHO IR será avaliada por meio de cromatografia em camada fina de alta eficiência (HP-TLC), enquanto as alterações na atividade do receptor de insulina serão quantificadas por análise de western blot após estimulação de insulina pós-troca lipídica.

Protocolo

1. Preparação da solução de metil-α-CD

1. Adicione 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a ~ 10 g de pó de MαCD em um frasco de vidro. Incubar em banho-maria morna (45 °C) para dissolver, mexendo ocasionalmente até dissolver bem.
   NOTA: A solução ainda pode estar turva devido a espécies insolúveis de CD.
2. Passe a solução por um filtro de seringa de 0,22 μm. A solução ficará clara.
3. Use um refratômetro para determinar a concentração exata de MαCD.
   1. Coloque 10 μL de amostra na área de amostra de um refratômetro, ilumine-o usando uma lâmpada incandescente branca e registre o índice de refração da solução.
   2. Calcule a concentração de MαCD usando a equação
      RI = (1,49 x 10 x C) + 1,33
      onde RI = índice de refração, C = concentração de MαCD (mM). A equação foi obtida por meio de análise gravimétrica, ou medida do índice de refração de um peso conhecido de MαCD dissolvido em um volume conhecido.
4. Feche a garrafa de vidro com uma tampa e envolva-a em um filme transparente para evitar a evaporação. Conservar a 4 °C.

2. Preparação de vesículas multilamelares (MLVs)

1. Manter soluções de reserva dos lípidos exógenos desejados dissolvidos em clorofórmio em concentrações de 20 mM a 50 mM e conservar a -20 °C ou menos para minimizar a evaporação do solvente.
   NOTA: Todos os lipídios na Tabela 1 podem ser totalmente dissolvidos em estoques de clorofórmio. No entanto, é possível que lipídios alternativos exijam clorofórmio 1:1: metanol para se dissolver completamente.
2. Alíquota de estoque de lipídios em tubos de borossilicato usando uma pipeta de deslocamento positivo com uma ponta de vidro. Alternativamente, uma microsseringa de vidro pode ser usada.
3. Secar alíquotas lipídicas num bloco de aquecimento a uma temperatura baixa de cerca de 50 °C sob uma corrente de gás N₂ até que todo o clorofórmio aparente evapore.
4. Remova o solvente restante do lipídio seco colocando o tubo em uma câmara de vácuo e expondo-o a um alto vácuo (abaixo de 200 mTorr) por 1 h.
5. Adicione o meio F-12 da Ham sem soro ao filme lipídico seco para atingir uma concentração final de 20 mM. Cubra com uma tampa ou fita de Teflon e aqueça em banho-maria a 70 °C por 5 min.
6. Vórtice para suspender lipídios e formar MLVs. A mídia agora deve aparecer nublada.
   NOTA: Alguns lipídios saturados podem não ser totalmente suspensos apenas por vórtice e podem precisar ser suspensos por pipetagem para cima e para baixo até que o filme não seja mais visível.
   1. Transfira todo o volume para um tubo de microcentrífuga. Os MLVs podem ser armazenados por até 3 dias a 4 °C.

3. Preparação de meios de troca lipídica

1. Adicione o estoque de MαCD a uma concentração final de 40 mM, juntamente com MLVs preparados à concentração lipídica final encontrada na Tabela 1.
   NOTA: Se forem usados MLVs armazenados a 4 °C, eles serão depositados no fundo do tubo. Aqueça até a temperatura ambiente e certifique-se de que eles sejam ressuspensos sacudindo ou agitando o tubo.
   1. Carregue os lipídios em MαCD incubando por 30 min em banho-maria a 37 ° C ou 55 ° C de acordo com a Tabela 1. A temperatura escolhida deve estar acima do ponto de fusão da fase gel-líquido do lipídio escolhido. A mídia deve passar de nublada a clara.
   2. Deixe o meio de troca lipídica esfriar até a temperatura ambiente por 30-60 min.

4. Tratamento de troca lipídica de células

1. Cultive células CHO IR a 37 ° C e 5% de CO₂ no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, 4,5 g / L de glicose) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 300 μg / mL de L-glutamina, 100 μg / mL de aminoácidos não essenciais, 50 μg / mL G418, 2 μM de metotrexato e 1x antibiótico-antimicótico.
   1. Semeie 1,5 x 10⁶ células em placas de 60 mm e cresça até que sejam 80% -90% confluentes.
   2. Lave as células 3x adicionando 1 mL de PBS e depois aspirando. Células famintas durante a noite em 2 mL de meio F12 sem soro.
2. Lave as células 3x com 1 mL de PBS. Adicione 1 ml de meio de troca preparado ou meio sem soro como controlo às células e incube durante 1 h à temperatura ambiente (25 °C -27 °C). Agite as células a cada 15 minutos para garantir uma exposição uniforme aos meios de troca.
   1. Lave as células 3x com 1 mL de PBS. Cada placa pode ser posteriormente processada para extração de lipídios na etapa 5 ou para autofosforilação de IR na etapa 7.

5. Extração de lipídios em placa de cultura de células

1. Remova completamente o PBS e coloque a placa em um ângulo de 45° por 10 min ou até secar completamente, removendo qualquer tampão que possa se acumular ao longo do fundo.
2. Adicione 1 mL de solução de hexano: isopropanol 3:2 (v:v) às células secas e incube por 10 min em um shaker em temperatura ambiente.
3. Transfira a solução para um tubo de borossilicato. Cubra com fita de Teflon e guarde a -20 °C.
4. Dissolva os detritos celulares restantes adicionando 500 μL de NaOH 1N e agitando por 10 min em temperatura ambiente.
   1. Use esta solução em um ensaio de quantificação de proteínas, como o Ensaio de Bradford, para determinar a concentração de proteínas de cada amostra. Esses valores de concentração podem ser usados para normalizar os volumes de carga dos extratos lipídicos em placas HP-TLC para carga lipídica igual em todas as amostras.

6. Verificando a eficiência da troca com HP-TLC

1. Faça 100 mL de 65:25:5 (v:v:v) clorofórmio:metanol:30% (v/v) de hidróxido de amônio e despeje em um tanque de vidro TLC. Cubra bem e deixe o vapor se equilibrar por pelo menos 1 h.
2. Secar a amostra de extracto lipídico num bloco de aquecimento a baixa temperatura sob uma corrente de gás N₂ até que todo o solvente orgânico aparente evapore.
3. Dissolver a película lipídica em 50 μL de clorofórmio 1:1 (v:v) metanol.
4. Use uma seringa Hamilton de 10 μL para carregar 1-10 μL de amostra em bandas de 1 cm em uma placa de sílica HP-TLC. Coloque no máximo 10 faixas em um prato de 20 cm. Use valores normalizados para determinar os volumes necessários para carregar quantidades iguais de lipídios em todas as amostras.
   NOTA: Antes de carregar cada sample, a placa deve ser ativada colocando-a em uma placa quente em uma configuração média-alta.
5. Coloque a placa na vertical no tanque de TLC e deixe a frente do solvente se deslocar 8 cm para garantir a separação das espécies de fosfolipídios.
6. Deixe o prato secar por 10 min. Pulverize com uma solução aquosa de acetato cúprico a 3% (p / v) e ácido fosfórico a 8% (v / v).
   1. Deixe o prato secar por 30 min em temperatura ambiente ou com uma pistola de ar quente. A placa deve mudar de azul translúcido para branco opaco.
7. Carbonize a placa em um forno de 180 ° C-200 ° C por 5-10 min ou até que as faixas lipídicas pretas se tornem detectáveis.

7. Verificando a ativação do receptor com ensaio de autofosforilação e western blot

1. Incubar células com 500 μL de insulina 100 nM em meio sem soro à temperatura ambiente por 5 min.
2. Lave as células com PBS gelado e coloque as células no gelo para interromper a estimulação. Adicione imediatamente 1 mL de PBS gelado às células e colha com um raspador de células. Células de pellets a 3000 x g durante 5 min a 4 °C.
3. Adicione 100-200 μL de tampão de lise RIPA completo (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v / v) Triton X-100, 1% (p / v) desoxicolato de sódio, 1 mM de ortovanadato de sódio ativado, 10 μg / mL de aprotinina, 10 μg / mL de leupeptina) ao pellet celular em gelo. Pipete para cima e para baixo 30x-40x para lisar.
4. Incubar lisado no gelo por 10 min. Limpe o lisado de detritos celulares girando a 16.000 x g por 10 min a 4 ° C e coletando o sobrenadante. Reserve cerca de 20 μL de lisado para determinar a concentração de proteína com o ensaio de Bradford.
5. Combine o lisado com tampão Laemmli 5x (350 mM Tris HCl pH 6,8, 30% v / v glicerol, 10% p / v SDS, 25% v / v β-mercaptoetanol, 0,002 g de azul de bromofenol) e ferva a 95 ° C por 5 min. O volume de tampão adicionado deve ser suficiente para atingir uma concentração final de 1x tampão Laemmli.
6. Execute os lisados através de eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE).
   1. Carregue a mesma massa de proteína para todas as amostras junto com o marcador de peso molecular em um gel SDS-PAGE. Opere a 100 V-150 V em tampão de corrida (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM de glicina, 0,01% (p / v) SDS) até que seja bem resolvido na faixa de 100-250 kDa.
7. Transferir para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) em tampão de transferência (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM de glicina) durante 1 h a 100 V e 4 °C.
8. Bloqueie a membrana de PVDF por 30 min em temperatura ambiente em solução BSA a 5% em TBST (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween 20).
9. Incubar com anticorpo IR pYpY ou anticorpo IR-β na concentração de 1:1000 em solução BSA a 5% em TBST por 1 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
   NOTA: O anticorpo pYpY IR reconhece especificamente as tirosinas fosforiladas 1162 e 1163 e serve para indicar a autofosforilação do receptor. O anticorpo IR-β reconhece a subunidade beta do receptor indiscriminadamente, independentemente do estado de fosforilação, e serve para indicar os níveis globais do receptor.
10. Lave 3x com TBST em temperatura ambiente. Incubar com α anticorpo Rabbit-HRP em uma concentração de 1:3000 em solução de BSA a 1% em TBST por 30 min em temperatura ambiente.
11. Lave 3x com TBST em temperatura ambiente. Incube com substrato quimioluminescente aprimorado (ECL) por 1 min e crie uma imagem do filme.

Resultados

Para demonstrar a mudança observável na composição lipídica celular após a troca, realizamos HP-TLC em células CHO IR após a troca de SM cerebral (bSM) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) (Figura 1). Nos casos em que esfingomielinas como bSM estão sendo usadas para troca, um aumento na intensidade da banda SM é aparente, juntamente com uma diminuição na intensidade da banda PC em relação ao controle não tratado. Por outro lado, ao t...

Discussão

Desde a conceituação da existência de jangadas lipídicas na membrana celular, houve inúmeras tentativas de visualizá-las nas células e estudar a associação de lipídios e receptores. Experimentos envolvendo microscopia¹¹ em células usaram biomarcadores marcados com fluorescência, geralmente, proteínas e lipídios conhecidos por se associarem a jangadas, para estudar visualmente a localização de domínios lipídicos ordenados na célula

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)	Avanti Polar Lipids	850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids	850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457
Anti-insulin receptor β antibody	Cell Signaling Technology	CST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibody	R&D Systems Inc.	AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)	Thermo Fisher Scientific	14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)	Avanti Polar Lipids	860062
Egg sphingomyelin (eSM)	Avanti Polar Lipids	860061
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-016-CV
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Gibco ham’s F12 media	Thermo Fisher Scientific	11765054
Gibco L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)	Merck	HP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF Membrane	Millipore	IPVH00010
Methotrexate	Sigma Aldrich	454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)	AraChem	CDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32106
Sodium orthovanadate, Activated	Sigma Aldrich	5.08605