Ensayo de intercambio de lípidos en células vivas

Resumen

Describimos un método para utilizar la ciclodextrina para mediar el intercambio entre lípidos de la membrana plasmática con lípidos exógenos. Esta técnica se puede combinar con experimentos que estudian proteínas transmembrana, que se comportan de manera diferente en entornos lipídicos similares a balsas que en entornos no similares a balsas.

Resumen

Las balsas lipídicas son dominios dinámicos y ordenados en la membrana plasmática que a menudo se forman durante la agrupación y señalización de proteínas de membrana. La identidad lipídica de la valva externa impulsa la propensión de la membrana a formar balsas lipídicas. La naturaleza transitoria de las balsas lipídicas dificulta su estudio en células vivas. Por lo tanto, los métodos que agregan o eliminan lípidos formadores de balsas en la valva externa de las células vivas facilitan el estudio de las características de las balsas, como sus efectos sobre las proteínas de membrana. Los experimentos de intercambio de lípidos desarrollados en nuestro laboratorio utilizan ciclodextrinas cargadas de lípidos para eliminar y agregar fosfolípidos exógenos para cambiar la constitución lipídica de la membrana plasmática. La sustitución de la membrana por un lípido formador de balsas o no formadores de balsas puede ayudar a estudiar los efectos sobre la actividad de las proteínas transmembrana. En este trabajo describimos un método para el intercambio de lípidos en la valva externa de la membrana plasmática utilizando ciclodextrina cargada de lípidos. Demostramos la preparación de los medios de intercambio y el posterior tratamiento de las células de mamíferos adheridas. También mostramos cómo medir la eficiencia del intercambio utilizando HP-TLC. Este protocolo produce un reemplazo casi completo de la valva externa con lípidos exógenos sin alterar la viabilidad celular, lo que permite una mayor experimentación en membranas plasmáticas intactas modificadas.

Introducción

La membrana plasmática está compuesta por una bicapa lipídica enriquecida con varias proteínas de membrana, incluidos los receptores transmembrana y los canales iónicos. Los dominios lipídicos dentro de la membrana se han dilucidado a través de regiones solubles e insolubles en detergente identificadas en experimentos de fraccionamiento de membranas resistentes a detergentes (DRM)¹. Las fracciones insolubles se caracterizaron por estar enriquecidas en colesterol, esfingomielinas muy compactas y fosfolípidos saturados, exhibiendo puntos de fusión más altos, en contraste con las fracciones solubles que consisten predominantemente en una temperatura de fusión más baja y fosfolípidos insaturados poco empaquetados. Las regiones compactas se denominan dominios lipídicos de orden líquido (Lo), o balsas lipídicas, mientras que los dominios lipídicos desordenados por líquidos (Ld) más poco organizados son las regiones no en balsa de la membrana plasmática ^2,3. Se sabe que las regiones de balsas lipídicas facilitan los procesos de señalización, con evidencias que indican que el receptor activo de insulina se asocia con estas balsas ^4,5. Sin embargo, debido a la naturaleza dinámica de la membrana celular y al tamaño generalmente pequeño de los dominios, la visualización directa de la presencia de balsas en las células vivas presenta desafíos significativos. En este contexto, presentamos un método para investigar el impacto de las balsas lipídicas en el receptor de insulina mediante técnicas de intercambio lipídico.

Las ciclodextrinas (CD) están formadas por monómeros de glucosa unidos que crean una estructura en forma de anillo con una cavidad central. El tamaño de esta cavidad está determinado por el número de unidades de glucosa: seis unidades forman alfa-ciclodextrina (α-CD), mientras que siete unidades crean beta-ciclodextrinas (β-CD). Las CD son moléculas altamente solubles en agua capaces de encapsular lípidos dentro de su cavidad, facilitando así su transporte a la membrana celular⁶. Las beta-ciclodextrinas se han utilizado ampliamente para agregar y eliminar lípidos de las membranas⁷; sin embargo, su cavidad más grande carece de especificidad para el colesterol o los fosfolípidos⁸. Por el contrario, las alfa-ciclodextrinas, con su cavidad más pequeña, exhiben una mayor selectividad en la unión de moléculas lipídicas sobre esteroles. En concreto, la metil-α-ciclodextrina (metil-α-CDs) no interactúa con los esteroles y se ha utilizado eficazmente para intercambiar fosfolípidos y esfingomielinas sin alterar la composición colesterolosa de la membrana celular ^8,9.

En este manuscrito, proporcionamos un protocolo detallado para el uso de metil-α-CDs (MαCD) para intercambiar lípidos en la valva externa de la membrana celular con lípidos exógenos que tienen propiedades que promueven o interrumpen la formación de balsas lipídicas. Este intercambio se utiliza para investigar el impacto de las balsas lipídicas en la actividad de los receptores de insulina. La demostración se centrará en la introducción de un fosfolípido y una esfingomielina que afectan a la formación de dominios de orden líquido (Lo) en la membrana plasmática de líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) que sobreexpresan de forma estable el receptor de insulina (IR)¹⁰. El grado de intercambio de lípidos en las células CHO IR se evaluará mediante cromatografía en capa fina de alta resolución (HP-TLC), mientras que los cambios en la actividad del receptor de insulina se cuantificarán mediante análisis de Western blot después de la estimulación de la insulina después del intercambio de lípidos.

Protocolo

1. Preparación de la solución de metil-α-CD

1. Agregue 20 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a ~10 g de polvo de MαCD en una botella de vidrio. Incubar en un baño de agua tibia (45 °C) para que se disuelva, revolviendo ocasionalmente hasta que esté bien disuelto.
   NOTA: La solución aún puede estar turbia debido a las especies de CD insolubles.
2. Pase la solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. La solución se hará evidente.
3. Utilice un refractómetro para determinar la concentración exacta de MαCD.
   1. Coloque 10 μL de muestra en el área de muestra de un refractómetro, ilumínela con una bombilla incandescente blanca y registre el índice de refracción de la solución.
   2. Calcule la concentración de MαCD usando la ecuación
      RI = (1,49 x 10 x C) + 1,33
      donde RI = Índice de refracción, C = concentración de MαCD (mM). La ecuación se obtuvo mediante análisis gravimétrico, es decir, midiendo el índice de refracción de un peso conocido de MαCD disuelto en un volumen conocido.
4. Cierre la botella de vidrio con una tapa y envuelva la tapa en una película transparente para evitar la evaporación. Conservar a 4 °C.

2. Preparación de vesículas multilaminares (MLV)

1. Mantener soluciones madre de lípidos exógenos deseados disueltos en cloroformo en concentraciones de 20 mM a 50 mM y almacenarlas a -20 °C o menos para minimizar la evaporación del disolvente.
   NOTA: Todos los lípidos de la Tabla 1 pueden disolverse completamente en reservas de cloroformo. Sin embargo, es posible que los lípidos alternativos requieran cloroformo: metanol 1:1 para disolverse por completo.
2. Stock lipídico alícuota en tubos de borosilicato utilizando una pipeta de desplazamiento positivo con punta de vidrio. Alternativamente, se puede utilizar una microjeringa de vidrio.
3. Secar la alícuota lipídica en un bloque calefactor a un nivel bajo de unos 50 °C bajo una corriente de gas N₂ hasta que se evapore todo el cloroformo aparente.
4. Retire el disolvente restante del lípido seco colocando el tubo en una cámara de vacío y exponiéndolo a un alto vacío (menos de 200 mTorr) durante 1 h.
5. Agregue el medio F-12 de Ham sin suero a la película lipídica seca para alcanzar una concentración final de 20 mM. Cubrir con una tapa o cinta de teflón y calentar en un baño de agua a 70 °C durante 5 min.
6. Vórtice para suspender lípidos y formar MLVs. Los medios ahora deberían aparecer nublados.
   NOTA: Es posible que algunos lípidos saturados no se suspendan completamente solo por vórtice y es posible que deban suspenderse pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que la película ya no sea visible.
   1. Transfiera todo el volumen a un tubo de microcentrífuga. Los MLV pueden almacenarse hasta 3 días a 4 °C.

3. Preparación de medios de intercambio de lípidos

1. Agregue el stock de MαCD a una concentración final de 40 mM, junto con los MLV preparados a la concentración final de lípidos que se encuentra en la Tabla 1.
   NOTA: Si se utilizan MLV almacenados a 4 °C, se depositarán en el fondo del tubo. Caliéntelos a temperatura ambiente y asegúrese de que se resuspendan agitando o agitando el tubo.
   1. Cargue los lípidos en MαCD incubando durante 30 min en un baño de agua a 37 °C o 55 °C de acuerdo con la Tabla 1. La temperatura elegida debe estar por encima del punto de fusión de la fase gel-líquido del lípido elegido. Los medios deben pasar de nublados a claros.
   2. Deje que los medios de intercambio de lípidos se enfríen a temperatura ambiente durante 30-60 minutos.

4. Tratamiento de intercambio lipídico de células

1. Cultive células CHO IR a 37 °C y 5 % de CO₂ en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L de glucosa) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 300 μg/mL de L-glutamina, 100 μg/mL de aminoácidos no esenciales, 50 μg/mL de G418, 2 μM de metotrexato y 1x antibiótico-antimicótico.
   1. Siembre 1,5 x 10⁶ celdas en placas de 60 mm y crezca hasta que sean 80%-90% confluentes.
   2. Lave las celdas 3 veces agregando 1 mL de PBS y luego aspirando. Prive a las células durante la noche en 2 ml de medios F12 de Ham sin suero.
2. Lave las celdas 3 veces con 1 mL de PBS. Añada 1 mL de medio de intercambio preparado o medio sin suero como control a las células e incube durante 1 h a temperatura ambiente (25 °C -27 °C). Gire las celdas cada 15 minutos para garantizar una exposición uniforme a los medios de intercambio.
   1. Lave las celdas 3 veces con 1 mL de PBS. Cada placa puede procesarse posteriormente para la extracción de lípidos en el paso 5, o para la autofosforilación IR en el paso 7.

5. Extracción de lípidos en placa de cultivo celular

1. Retire completamente el PBS y coloque la placa en un ángulo de 45° durante 10 minutos o hasta que esté completamente seca, eliminando cualquier tampón que pueda acumularse a lo largo de la parte inferior.
2. Añadir 1 mL de solución de hexano: isopropanol 3:2 (v:v) a las células secas e incubar durante 10 min en un agitador a temperatura ambiente.
3. Transfiera la solución a un tubo de borosilicato. Cubra con cinta de teflón y almacene a -20 °C.
4. Disuelva los restos celulares restantes agregando 500 μL de NaOH 1N y agitando durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   1. Utilice esta solución en un ensayo de cuantificación de proteínas, como el ensayo de Bradford, para determinar la concentración de proteínas de cada muestra. Estos valores de concentración se pueden utilizar para normalizar los volúmenes de carga de los extractos de lípidos en las placas HP-TLC para una carga lipídica igual en todas las muestras.

6. Comprobación de la eficiencia del intercambio con HP-TLC

1. Prepare 100 ml de cloroformo: metanol: 30% (v/v) de hidróxido de amonio 65:25:5 (v:v:v) y viértalo en un tanque de vidrio TLC. Cubra herméticamente y deje que el vapor se equilibre durante al menos 1 hora.
2. Muestra de extracto lipídico seco en un bloque calefactor a baja temperatura bajo una corriente de gas N₂ hasta que se evapore todo el disolvente orgánico aparente.
3. Disolver la película lipídica en 50 μL de cloroformo 1:1 (v:v): metanol.
4. Utilice una jeringa Hamilton de 10 μL para cargar 1-10 μL de muestra en bandas de 1 cm en una placa HP-TLC de sílice. Cargue un máximo de 10 bandas en un plato de 20 cm. Utilice valores normalizados para determinar los volúmenes necesarios para cargar cantidades iguales de lípidos en todas las muestras.
   NOTA: Antes de cargar cada muestra, la placa debe activarse colocándola sobre una placa caliente a un ajuste medio-alto.
5. Coloque la placa en posición vertical en el tanque TLC y deje que el frente del solvente se desplace 8 cm para garantizar la separación de las especies de fosfolípidos.
6. Deja que el plato se seque durante 10 min. Rocíe con una solución acuosa de acetato cúprico al 3% (p/v) y ácido fosfórico al 8% (v/v).
   1. Deje secar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente o con una pistola de calor. La placa debe cambiar de azul translúcido a blanco opaco.
7. Carbonizar la placa en un horno de 180 °C-200 °C durante 5-10 minutos o hasta que las bandas lipídicas negras sean detectables.

7. Comprobación de la activación del receptor con ensayo de autofosforilación y Western blot

1. Incubar las células con 500 μL de insulina 100 nM en medios sin suero a temperatura ambiente durante 5 min.
2. Lave las células con PBS helada y póngalas en hielo para detener la estimulación. Agregue rápidamente 1 ml de PBS helado a las células y coseche con un raspador de células. Celdas de pellets a 3000 x g durante 5 min a 4 °C.
3. Añada 100-200 μL de tampón de lisis RIPA completo (50 mM de Tris pH 8, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% (v/v) de Triton X-100, 1% (p/v) de desoxicolato de sodio, 1 mM de ortovanadato de sodio activado, 10 μg/mL de aprotinina, 10 μg/mL de leupeptina) a la célula en hielo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 30x-40x para lisar.
4. Incubar el lisado en hielo durante 10 min. Limpie el lisado de los restos celulares centrifugando a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C y recogiendo el sobrenadante. Reserve unos 20 μL de lisado para determinar la concentración de proteínas con el ensayo de Bradford.
5. Combine el lisado con 5 tampones Laemmli (350 mM de Tris HCl pH 6,8, 30% v/v glicerol, 10% p/v SDS, 25% v/v β-mercaptoetanol, 0,002 g de azul de bromofenol) y hierva a 95 °C durante 5 min. El volumen de tampón añadido debe ser suficiente para alcanzar una concentración final de 1x tampón Laemmli.
6. Ejecute los lisados mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE).
   1. Cargue la misma masa de proteína para todas las muestras junto con el marcador de peso molecular en un gel SDS-PAGE. Ejecute a 100 V-150 V en tampón de funcionamiento (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM de glicina, 0,01% (p/v) SDS) hasta que se resuelva bien en el rango de 100-250 kDa.
7. Transfiera a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) en tampón de transferencia (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glicina) durante 1 h a 100 V y 4 °C.
8. Bloquee la membrana de PVDF durante 30 min a temperatura ambiente en una solución de BSA al 5% en TBST (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20).
9. Incubar con anticuerpo pYpY IR o anticuerpo IR-β a una concentración de 1:1000 en una solución de BSA al 5% en TBST durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
   NOTA: El anticuerpo pYpY IR reconoce específicamente las tirosinas fosforiladas 1162 y 1163 y sirve para indicar la autofosforilación del receptor. El anticuerpo IR-β reconoce la subunidad beta del receptor indiscriminadamente independientemente del estado de fosforilación y sirve para indicar los niveles globales del receptor.
10. Lavar 3 veces con TBST a temperatura ambiente. Incubar con α anticuerpo Rabbit-HRP a una concentración de 1:3000 en una solución de BSA al 1% en TBST durante 30 minutos a temperatura ambiente.
11. Lavar 3 veces con TBST a temperatura ambiente. Incubar con sustrato quimioluminiscente mejorado (ECL) durante 1 minuto y obtener una imagen de la película.

Resultados

Para demostrar el cambio observable en la composición de lípidos celulares después del intercambio, realizamos HP-TLC en células CHO IR después del intercambio de SM cerebral (bSM) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) (Figura 1). En los casos en los que se utilizan esfingomielinas como bSM para el intercambio, es evidente un aumento en la intensidad de la banda SM, junto con una disminución en la intensidad de la banda PC en relación con el ...

Discusión

Desde la conceptualización de la existencia de balsas lipídicas en la membrana celular, ha habido numerosos intentos de visualizarlas en las células y estudiar la asociación de lípidos y receptores. Los experimentos con microscopía¹¹ en células utilizaron biomarcadores marcados con fluorescencia, por lo general, proteínas y lípidos que se sabe que se asocian con balsas, para estudiar visualmente la localización de dominios lipídicos ordenados en la cél...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)	Avanti Polar Lipids	850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids	850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457
Anti-insulin receptor β antibody	Cell Signaling Technology	CST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibody	R&D Systems Inc.	AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)	Thermo Fisher Scientific	14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)	Avanti Polar Lipids	860062
Egg sphingomyelin (eSM)	Avanti Polar Lipids	860061
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-016-CV
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Gibco ham’s F12 media	Thermo Fisher Scientific	11765054
Gibco L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)	Merck	HP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF Membrane	Millipore	IPVH00010
Methotrexate	Sigma Aldrich	454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)	AraChem	CDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32106
Sodium orthovanadate, Activated	Sigma Aldrich	5.08605