Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה לשימוש בציקלודקסטרין כדי לתווך חילופי שומנים של קרום הפלזמה עם ליפידים אקסוגניים. ניתן לשלב טכניקה זו עם ניסויים החוקרים חלבונים טרנסממברניים, המתנהגים באופן שונה בסביבות דמויות רפסודת שומנים מאשר בסביבות שאינן דמויות רפסודה.

Abstract

רפסודות שומנים הן תחומים דינמיים ומסודרים בקרום הפלזמה הנוצרים לעתים קרובות במהלך אשכול חלבון הממברנה ואיתות. זהות השומנים של העלון החיצוני מניעה את נטיית הממברנה ליצור רפסודות שומנים. האופי הארעי של רפסודות השומנים מקשה על המחקר בתאים חיים. לכן, שיטות המוסיפות או מסירות שומנים יוצרי רפסודה בעלון החיצוני של תאים חיים מקלות על חקר המאפיינים של רפסודות, כגון השפעותיהן על חלבוני הממברנה. ניסויי חילופי שומנים שפותחו במעבדה שלנו משתמשים בציקלודקסטרינים עמוסים בשומנים כדי להסיר ולהוסיף פוספוליפידים אקסוגניים כדי לשנות את מבנה השומנים של קרום הפלזמה. החלפת הממברנה ברפסודה או בשומן שאינו יוצר רפסודה יכולה לסייע בחקר ההשפעות על פעילות החלבון הטרנסממברני. כאן, אנו מתארים שיטה להחלפת שומנים על העלון החיצוני של קרום הפלזמה באמצעות ציקלודקסטרין עמוס שומנים. אנו מדגימים את הכנת אמצעי ההחלפה ואת הטיפול לאחר מכן בתאי יונקים מחוברים. אנו גם מציגים כיצד למדוד את יעילות ההחלפה באמצעות HP-TLC. פרוטוקול זה מניב החלפה כמעט מלאה של העלון החיצוני בשומנים אקסוגניים מבלי לשנות את הכדאיות התאית, מה שמאפשר ניסויים נוספים על ממברנות פלזמה שלמות ששונו.

Introduction

קרום הפלזמה מורכב משכבה דו-שכבתית של שומנים המועשרת בחלבוני ממברנה שונים, כולל קולטנים טרנסממברניים ותעלות יונים. תחומי השומנים בתוך הממברנה הובהרו באמצעות אזורים מסיסים ובלתי מסיסים בחומרי ניקוי שזוהו בניסויי פיצול ממברנה עמידה לחומרי ניקוי (DRM)1. השברים הבלתי מסיסים התאפיינו בכך שהם מועשרים בכולסטרול, ספינגומיאלינים ארוזים היטב ופוספוליפידים רוויים, המציגים נקודות התכה גבוהות יותר, בניגוד לשברים המסיסים המורכבים בעיקר מטמפרטורת התכה נמוכה יותר ופוספוליפידים בלתי רוויים ארוזים באופן רופף. האזורים הארוזים היטב מכונים תחומי ליפידים בסדר נוזלי (Lo), או רפסודות שומנים, בעוד שתחומי השומנים המאורגנים יותר בהפרעות נוזליות (Ld) הם האזורים שאינם רפסודה של קרום הפלזמה 2,3. אזורי רפסודת שומנים ידועים כמקלים על תהליכי איתות, עם עדויות המצביעות על כך שקולטן האינסולין הפעיל מתקשר לרפסודות אלה 4,5. עם זאת, בשל האופי הדינמי של קרום התא והגודל הקטן בדרך כלל של התחומים, הדמיה ישירה של נוכחות רפסודות בתאים חיים מציבה אתגרים משמעותיים. בהקשר זה, אנו מציגים שיטה לחקירת ההשפעה של רפסודות שומנים על קולטן האינסולין באמצעות טכניקות חילופי שומנים.

ציקלודקסטרינים (CDs) נוצרים על ידי מונומרים מקושרים של גלוקוז היוצרים מבנה דמוי טבעת עם חלל מרכזי. גודל חלל זה נקבע על פי מספר יחידות הגלוקוז: שש יחידות יוצרות אלפא-ציקלודקסטרין (α-CD), בעוד שבע יחידות יוצרות בטא-ציקלודקסטרינים (β-CDs). CDs הם מולקולות מסיסות מאוד במים המסוגלות לעטוף שומנים בתוך החלל שלהם, ובכך להקל על הובלתם לקרום התא6. בטא-ציקלודקסטרינים שימשו באופן נרחב להוספה והסרה של שומנים מממברנות7; עם זאת, החלל הגדול יותר שלו חסר ספציפיות לכולסטרול או פוספוליפידים8. לעומת זאת, אלפא-ציקלודקסטרין, עם החלל הקטן יותר שלהם, מפגינים סלקטיביות רבה יותר בקשירת מולקולות ליפידים על פני סטרולים. באופן ספציפי, מתיל-α-ציקלודקסטרין (מתיל-α-CDs) אינו מקיים אינטראקציה עם סטרולים ושימש ביעילות להחלפת פוספוליפידים וספינגומילינים מבלי לשנות את הרכב הכולסטרול של קרום התא 8,9.

בכתב יד זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש במתיל-α-CDs (MαCD) להחלפת שומנים בעלון החיצוני של קרום התא עם ליפידים אקסוגניים בעלי תכונות המקדמות או משבשות היווצרות רפסודות שומנים. חילוף זה משמש לחקירת ההשפעה של רפסודות שומנים על פעילות קולטני האינסולין. ההדגמה תתמקד בהכנסת פוספוליפיד וספינגומיאלין המשפיעים על היווצרות תחומים בסדר נוזלי (Lo) בקרום הפלזמה של קווי תאי שחלת האוגר הסיני (CHO) המבטאים יתר על המידה את קולטן האינסולין (IR)10. היקף חילופי השומנים בתאי CHO IR יוערך באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה בעלת ביצועים גבוהים (HP-TLC), בעוד ששינויים בפעילות קולטני האינסולין יכומתו על ידי ניתוח כתמים מערביים לאחר גירוי אינסולין לאחר החלפת שומנים.

Protocol

1. הכנת תמיסת מתיל-α-CD

  1. הוסף 20 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ל~10 גרם אבקת MαCD בבקבוק זכוכית. יש לדגור באמבט מים חמים (45 מעלות צלזיוס) להמסה, תוך ערבוב מדי פעם עד להמסה טובה.
    הערה: התמיסה עשויה עדיין להיות עכורה עקב מיני CD בלתי מסיסים.
  2. העבירו תמיסה דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר. הפתרון יתבהר.
  3. השתמש ברפרקטומטר כדי לקבוע את הריכוז המדויק של MαCD.
    1. הניחו 10 מיקרוליטר של דגימה על שטח הדגימה של רפרקטומטר, האירו אותה באמצעות נורת ליבון לבנה ורשמו את מקדם השבירה של התמיסה.
    2. חשב את ריכוז MαCD באמצעות המשוואה
      RI = (1.49 x 10 x C) + 1.33
      כאשר RI = מקדם שבירה, C = ריכוז MαCD (mM). המשוואה הושגה באמצעות ניתוח גרבימטרי, או מדידת מקדם השבירה של משקל ידוע של MαCD המומס בנפח ידוע.
  4. סוגרים את בקבוק הזכוכית עם מכסה ועוטפים את המכסה בסרט שקוף למניעת אידוי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. הכנת שלפוחיות רב-שכבתיות (MLV)

  1. שמור על תמיסות מלאי של שומנים אקסוגניים רצויים מומסים בכלורופורם בריכוזים של 20 מ"מ עד 50 מ"מ ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס ומטה כדי למזער את אידוי הממס.
    הערה: ניתן להמיס את כל השומנים בטבלה 1 במלואם במלאי הכלורופורם. עם זאת, ייתכן ששומנים חלופיים עשויים לדרוש כלורופורם 1:1: מתנול כדי להתמוסס במלואו.
  2. ציר שומנים Aliquot לתוך צינורות בורוסיליקט באמצעות פיפטה בעלת תזוזה חיובית עם קצה זכוכית. לחלופין, ניתן להשתמש במיקרו-מזרק זכוכית.
  3. לייבש את השומנים על בלוק חימום בטמפרטורה נמוכה של כ-50 מעלות צלזיוס תחת זרם של גז N2 עד שכל הכלורופורם הנראה לעין מתאדה.
  4. הסר את הממס שנותר מהליפיד המיובש על ידי הנחת הצינור בתא ואקום וחשיפתו לוואקום גבוה (מתחת ל-200 mTorr) למשך שעה.
  5. הוסף את מדיית ה-F-12 של Ham ללא סרום לשכבת שומן יבשה כדי להגיע לריכוז סופי של 20 מ"מ. מכסים במכסה או בנייר דבק טפלון ומחממים באמבט מים של 70 מעלות למשך 5 דקות.
  6. מערבולת להשהיית שומנים ויצירת MLV. המדיה אמורה להיראות כעת מעוננת.
    הערה: ייתכן שחלק מהשומנים הרוויים לא יושעו במלואם על ידי מערבולת בלבד וייתכן שיהיה צורך להשעות אותם על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עד שהסרט כבר לא נראה לעין.
    1. העבירו את כל הנפח לצינור מיקרוצנטריפוגה. ניתן לאחסן MLV עד 3 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

3. הכנת אמצעי חילופי שומנים

  1. הוסף מלאי MαCD לריכוז סופי של 40 מ"מ, יחד עם MLVs מוכנים לריכוז השומנים הסופי שנמצא בטבלה 1.
    הערה: אם משתמשים ב-MLV המאוחסנים ב-4 מעלות צלזיוס, הם ישקעו בתחתית הצינור. התחממו לטמפרטורת החדר וודאו שהם מושעים מחדש על ידי תנועה או ערבוב של הצינור.
    1. טען שומנים על MαCD על ידי דגירה למשך 30 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס או 55 מעלות צלזיוס לפי טבלה 1. הטמפרטורה שנבחרה צריכה להיות מעל נקודת ההיתוך של שלב הג'ל לנוזל של השומן הנבחר. התקשורת צריכה לעבור ממעונן לצלול.
    2. הניחו למדיית חילופי השומנים להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות.

4. טיפול בחילופי שומנים בתאים

  1. גדל תאי CHO IR ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 300 מיקרוגרם/מ"ל L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם/מ"ל חומצות אמינו לא חיוניות, 50 מיקרוגרם/מ"ל G418, 2 מיקרומטר מטוטרקסט ו-1x אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית.
    1. זרע 1.5 x 106 תאים בצלחות של 60 מ"מ וגדל עד שהם מתכנסים 80%-90%.
    2. שטפו תאים פי 3 על ידי הוספת 1 מ"ל PBS ולאחר מכן שאיבה. הרעיבו תאים למשך הלילה ב-2 מ"ל של חומר F12 נטול סרום.
  2. שטפו תאים פי 3 עם 1 מ"ל PBS. הוסף לתאים 1 מ"ל של אמצעי החלפה מוכנים או מדיה נטולת סרום כבקרה ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס -27 מעלות צלזיוס). סובב תאים כל 15 דקות כדי להבטיח חשיפה אחידה לאמצעי החלפה.
    1. שטפו תאים פי 3 עם 1 מ"ל PBS. לאחר מכן ניתן לעבד כל צלחת למיצוי שומנים בשלב 5, או לזרחון עצמי IR בשלב 7.

5. מיצוי שומנים על צלחת תרבית תאים

  1. הסר לחלוטין PBS והנח את הצלחת בזווית של 45 מעלות למשך 10 דקות או עד לייבוש מלא, והסר כל חיץ שעלול להצטבר לאורך התחתית.
  2. הוסף 1 מ"ל של 3:2 (v:v) הקסאן: תמיסת איזופרופנול לתאים המיובשים ודגירה למשך 10 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר.
  3. מעבירים את התמיסה לצינור בורוסיליקט. מכסים בנייר דבק טפלון ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  4. ממיסים את שאריות התא על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 1N NaOH וניעור למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    1. השתמש בתמיסה זו בבדיקת כימות חלבון כגון מבחן ברדפורד כדי לקבוע את ריכוז החלבון של כל דגימה. ניתן להשתמש בערכי ריכוז אלה כדי לנרמל את נפחי הטעינה של תמציות השומנים על לוחות HP-TLC להעמסת שומנים שווה בכל הדגימות.

6. בדיקת יעילות ההחלפה באמצעות HP-TLC

  1. הכינו 100 מ"ל של 65:25:5 (v:v:v) כלורופורם:מתנול:30% (v/v) אמוניום הידרוקסיד ושפכו אותו למיכל TLC מזכוכית. מכסים היטב ומאפשרים לאדים להתייצב למשך שעה לפחות.
  2. דגימת תמצית שומנים יבשה על בלוק חימום בהגדרה נמוכה מתחת לזרם של גז N2 עד שכל הממס האורגני לכאורה מתאדה.
  3. ממיסים את סרט השומנים ב-50 מיקרוליטר של כלורופורם 1:1 (v:v): מתנול.
  4. השתמש במזרק המילטון של 10 מיקרוליטר כדי לטעון 1-10 מיקרוליטר של דגימה ברצועות של 1 ס"מ על צלחת HP-TLC סיליקה. טען מקסימום 10 רצועות על צלחת 20 ס"מ. השתמש בערכים מנורמלים כדי לקבוע את הנפחים הדרושים לטעינת כמויות שוות של שומנים בכל הדגימות.
    הערה: לפני טעינת כל דגימה, יש להפעיל את הצלחת על ידי הנחתה על פלטה חמה בהגדרה בינונית-גבוהה.
  5. הנח את הצלחת זקופה במיכל TLC ואפשר לחזית הממס לנוע 8 ס"מ כדי להבטיח הפרדה של מיני פוספוליפידים.
  6. תן לצלחת להתייבש במשך 10 דקות. יש לרסס בתמיסה מימית של 3% (w/v) אצטט קופרי ו-8% (v/v) חומצה זרחתית.
    1. הניחו לצלחת להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר או בעזרת אקדח חום. הצלחת צריכה להפוך מכחול שקוף ללבן אטום.
  7. צלחת חרכה בתנור 180-200 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות או עד שניתן לזהות את רצועות השומנים השחורות.

7. בדיקת הפעלת קולטנים באמצעות בדיקת זרחון עצמי וכתם מערבי

  1. דגירה של תאים עם 500 מיקרוליטר של אינסולין 100 ננומטר במדיה נטולת סרום בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  2. שטפו תאים עם PBS קר כקרח והניחו תאים על קרח כדי לעצור את הגירוי. הוסף מיד 1 מ"ל PBS קר כקרח לתאים וקצור בעזרת מגרד תאים. תאי גלולה ב-3000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף 100-200 מיקרוליטר של מאגר ליזה מלא של RIPA (50 מ"מ Tris pH 8, 200 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (w/v) נתרן דאוקסיכולאט, 1 מ"מ נתרן אורתוואנדאט פעיל, 10 מיקרוגרם/מ"ל אפרוטינין, 10 מיקרוגרם/מ"ל לאופפטין) לכדור התא על קרח. פיפטה למעלה ולמטה 30x-40x לליז.
  4. דגרו ליזאט על קרח למשך 10 דקות. נקה ליזאט מפסולת תאים על ידי סיבוב ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואיסוף הסופרנטנט. שמור כ -20 מיקרוליטר ליזאט כדי לקבוע את ריכוז החלבון עם בדיקת ברדפורד.
  5. יש לערבב ליזאט עם 5x חוצץ Laemmli (350 מ"מ Tris HCl pH 6.8, 30% v/v גליצרול, 10% w/v SDS, 25% v/v β-מרקפטו-אתנול, 0.002 גרם ברומופנול כחול) ולהרתיח ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. נפח המאגר שנוסף אמור להספיק כדי להשיג ריכוז סופי של 1x מאגר Laemmli.
  6. הפעל ליזטים דרך אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE).
    1. טען מסה שווה של חלבון עבור כל הדגימות יחד עם סמן משקל מולקולרי על ג'ל SDS-PAGE. הפעל ב-100 V-150 V במאגר רץ (2.5 מ"מ Tris pH 8, 19.2 מ"מ גליצין, 0.01% (w/v) SDS) עד לפתרון טוב בטווח של 100-250 kDa.
  7. העבר על ממברנת פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) במאגר העברה (2.5 מ"מ Tris pH 8, 19.2 מ"מ גליצין) למשך שעה אחת ב-100V ו-4 °C.
  8. חסום את קרום PVDF למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתמיסת BSA של 5% ב-TBST (50 מ"מ Tris pH 8, 150 מ"מ NaCl, 0.1% (v/v) Tween 20).
  9. דגירה עם נוגדן pYpY IR או נוגדן IR-β בריכוז 1:1000 בתמיסת BSA 5% ב-TBST למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: נוגדן ה-pYpY IR מזהה באופן ספציפי טירוזינים זרחניים 1162 ו-1163 ומשמש לציון זרחון עצמי של הקולטן. נוגדן ה-IR-β מזהה את תת-יחידת הבטא של הקולטן ללא הבחנה ללא קשר למצב הזרחן ומשמש לציון רמות גלובליות של הקולטן.
  10. יש לשטוף 3 פעמים עם TBST בטמפרטורת החדר. דגירה עם נוגדן α Rabbit-HRP בריכוז 1:3000 בתמיסת BSA 1% ב-TBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. יש לשטוף 3 פעמים עם TBST בטמפרטורת החדר. דגירה עם מצע כימילומינסנט משופר (ECL) למשך דקה אחת וצלם את הסרט.

תוצאות

כדי להדגים את השינוי הנצפה בהרכב השומנים התאיים לאחר ההחלפה, ביצענו HP-TLC על תאי CHO IR לאחר חילופי SM במוח (bSM) ו-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) (איור 1). במקרים בהם משתמשים בספינגומיאלינים כמו bSM להחלפה, ניכרת עלייה בעוצמת פס ה-SM, יחד עם ירידה בעוצמת פס ה-PC ביחס לבקרה ה...

Discussion

מאז המשגת קיומן של רפסודות שומנים בקרום התא, נעשו ניסיונות רבים לדמיין אותם בתאים ולחקור את הקשר בין שומנים לקולטנים. ניסויים הכוללים מיקרוסקופיה11 בתאים השתמשו בסמנים ביולוגיים מתויגים פלואורסצנטיים, בדרך כלל, חלבונים ושומנים הידועים כקשורים לרפסודות, כד?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

המימון ניתן על ידי מענק NIH GM 122493. תאי IR של CHO היו מתנה נדיבה מד"ר ג'ונתן ויטאקר (אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)Avanti Polar Lipids850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids850457
Anti-insulin receptor β antibodyCell Signaling TechnologyCST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibodyR&D Systems Inc.AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)Thermo Fisher Scientific14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)Avanti Polar Lipids860062
Egg sphingomyelin (eSM)Avanti Polar Lipids860061
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-016-CV
G418 disulfate saltSigma AldrichA1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)Thermo Fisher Scientific11965092
Gibco ham’s F12 mediaThermo Fisher Scientific11765054
Gibco L-glutamineThermo Fisher Scientific25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)MerckHP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF MembraneMilliporeIPVH00010
MethotrexateSigma Aldrich454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)AraChemCDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermo Fisher Scientific32106
Sodium orthovanadate, ActivatedSigma Aldrich5.08605

References

  1. Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Brown, D. A. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Physiology. 21, 430-439 (2006).
  3. Schroeder, R., London, E., Brown, D. Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).
  4. Suresh, P., Miller, W. T., London, E. Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains. J Biol Chem. 297 (3), 101010 (2021).
  5. Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).
  6. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).
  7. Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes. Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).
  8. Suresh, P., London, E. Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774 (2022).
  9. Li, G., et al. Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).
  10. Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).
  11. Gaus, K., et al. Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).
  12. Klymchenko, S., Kreder, R. Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells. Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).
  13. Pike, L. J. Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story. Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).
  14. Brown, D. A., London, E. Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes. Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).
  15. Lin, Q., London, E. Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry. PLoS One. 9 (1), e87903 (2014).
  16. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  17. Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. How lipid flippases can modulate membrane structure. Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).
  18. Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis. J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).
  19. Li, G., et al. Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity. PLoS One. 14 (10), e0223572 (2019).
  20. Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes. FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).
  21. Suresh, P., London, E. MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity. Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HP TLC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved