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要約

シクロデキストリンを使用して、原形質膜の脂質と外因性脂質との交換を仲介する方法について説明します。この手法は、脂質ラフト様環境と非ラフト様環境で異なる振る舞いをする膜貫通タンパク質を研究する実験と組み合わせることができます。

要約

脂質ラフトは、細胞膜内の動的で秩序あるドメインであり、膜タンパク質のクラスタリングとシグナル伝達中に形成されることがよくあります。外側のリーフレットの脂質同一性は、膜が脂質ラフトを形成する傾向を促進します。脂質ラフトの一時的な性質は、生細胞での研究を困難にします。したがって、生細胞の外側のリーフレットでラフト形成脂質を追加または削除する方法は、膜タンパク質に対するラフトの影響など、ラフトの特性の研究を容易にします。当研究室で開発した脂質交換実験では、脂質を多く含むシクロデキストリンを用いて外因性リン脂質を除去・添加することで、原形質膜の脂質構成を変化させます。メンブレンをラフトまたは非ラフト形成脂質で置換すると、膜貫通タンパク質活性への影響を研究するのに役立ちます。ここでは、脂質をロードしたシクロデキストリンを用いて、原形質膜の外皮上で脂質を交換する方法について述べる。交換培地の調製とその後の付着哺乳動物細胞の処理を実演します。また、HP-TLCを使用して交換効率を測定する方法も紹介します。このプロトコルは、細胞の生存率を変えることなく、外側のリーフレットを外因性脂質でほぼ完全に置き換えることを可能にし、改変された無傷の原形質膜でのさらなる実験を可能にします。

概要

原形質膜は、膜貫通型受容体やイオンチャネルなど、さまざまな膜タンパク質が豊富な脂質二重膜で構成されています。膜内の脂質ドメインは、洗剤耐性膜(DRM)分画実験1で同定された界面活性剤可溶性および不溶性領域を通じて解明されています。不溶性画分は、コレステロール、密集したスフィンゴミエリン、および飽和リン脂質が豊富であることを特徴とするが、これは、主に低い融点と緩く充填された不飽和リン脂質からなる可溶性画分とは対照的に、より高い融点を示す。密集した領域は、液体秩序(Lo)脂質ドメイン、または脂質ラフトと呼ばれ、一方、より緩やかに組織化された液体障害(Ld)脂質ドメインは、原形質膜の非ラフト領域である2,3。脂質ラフト領域はシグナル伝達プロセスを促進することが知られており、活性インスリン受容体がこれらのラフトと会合することを示す証拠があります4,5。しかし、細胞膜の動的な性質とドメインのサイズが一般的に小さいため、生細胞のラフトの存在を直接視覚化することは大きな課題です。これに関連して、脂質ラフトがインスリン受容体に及ぼす影響を脂質交換技術を通じて調査する方法を提示します。

シクロデキストリン(CD)は、結合したグルコースモノマーによって形成され、中央の空洞を持つ環状構造を形成します。この空洞のサイズはグルコース単位の数によって決まります:6単位がα-シクロデキストリン(α-CD)を形成し、7単位がβ-シクロデキストリン(β-CD)を生成します。CDは、脂質をそのキャビティ内にカプセル化することができる非常に水溶性の分子であり、したがって、細胞膜6への脂質の輸送を容易にする。β-シクロデキストリンは、膜に脂質を添加および除去するために広く使用されています7。しかし、その大きな空洞はコレステロールやリン脂質に対する特異性を欠いています8。対照的に、α-シクロデキストリンは、キャビティが小さいため、ステロールよりも脂質分子の結合においてより大きな選択性を示します。具体的には、メチル-α-シクロデキストリン(メチル-α-CD)はステロールと相互作用せず、細胞膜のコレステロール組成を変化させることなくリン脂質とスフィンゴミエリンを交換するために効果的に使用されてきた8,9。

この原稿では、メチルα-CD(MαCD)を使用して、細胞膜の外皮の脂質を、脂質ラフト形成を促進または破壊する特性を持つ外因性脂質と交換するための詳細なプロトコルを提供します。この交換は、脂質ラフトがインスリン受容体活性に及ぼす影響を調査するために使用されます。このデモンストレーションでは、インスリン受容体(IR)を安定して過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株の原形質膜における液体秩序型(Lo)ドメインの形成に影響を与えるリン脂質とスフィンゴミエリンの導入に焦点を当てます10。CHO IR細胞における脂質交換の程度は、高速薄層クロマトグラフィー(HP-TLC)によって評価されますが、インスリン受容体活性の変化は、脂質交換後のインスリン刺激後のウェスタンブロット分析によって定量化されます。

プロトコル

1. メチル-α-CD溶液の調製

  1. ガラス瓶内のMαCD粉末~10gにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)20mLを加えます。温水浴(45°C)でインキュベートして溶解し、よく溶解するまで時々攪拌します。
    注:不溶性のCD種により、溶液はまだ濁っている場合があります。
  2. 溶液を0.22 μmシリンジフィルターに通します。解決策が明らかになります。
  3. 屈折計を使用して、MαCDの正確な濃度を決定します。
    1. 屈折計のサンプル領域に10 μLのサンプルを置き、白色の白熱電球で照らし、溶液の屈折率を記録します。
    2. 次の式を使用してMαCD濃度を計算します
      RI = (1.49 x 10 x C) + 1.33
      ここで、RI =屈折率、C =MαCDの濃度(mM)。この方程式は、重量分析、または既知の体積に溶解した既知の重量のMαCDの屈折率を測定することによって得られました。
  4. ガラス瓶を蓋で閉め、蒸発を防ぐために蓋を透明フィルムで包みます。4°Cで保存してください。

2. マルチラメラベシクル(MLV)の調製

  1. クロロホルムに溶解した所望の外因性脂質のストック溶液を20 mM〜50 mMの濃度で保持し、溶媒の蒸発を最小限に抑えるために-20°C以下で保存します。
    注: 表1 のすべての脂質は、クロロホルムストックに完全に溶解できます。ただし、代替脂質が完全に溶解するためには、1:1のクロロホルム(メタノール)が必要な場合があります。
  2. ガラスチップ付きのポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して、脂質ストックをホウケイ酸チューブに分注します。あるいは、ガラス製のマイクロシリンジを使用することもできます。
  3. すべての見かけのクロロホルムが蒸発するまで、N2 ガスの流れの下で約50°Cの低温設定で加熱ブロック上で脂質アリコートを乾燥させます。
  4. チューブを真空チャンバーに入れ、高真空(200mTorr未満)に1時間さらして、乾燥脂質から残りの溶媒を取り除きます。
  5. 無血清のハムのF-12培地を乾燥脂質フィルムに添加し、最終濃度20 mMにします。蓋またはテフロンテープで覆い、70°Cのウォーターバスで5分間加熱します。
  6. ボルテックスにより脂質を懸濁させ、MLVを形成します。メディアが曇っているように見えます。
    注:一部の飽和脂質は、ボルテックスだけでは完全に懸濁しない場合があり、フィルムが見えなくなるまでピペッティングで上下させて懸濁する必要があります。
    1. 全ボリュームをマイクロ遠心チューブに移します。MLVは、4°Cで最大3日間保存できます。

3. 脂質交換培地の調製

  1. MαCDストックを最終濃度40 mMまで加え、調製したMLVを 表1に示す最終脂質濃度まで加えます。
    注:4°Cで保存されたMLVを使用する場合、MLVはチューブの底に沈殿します。室温まで温め、チューブをフリックまたは攪拌して再懸濁されていることを確認します。
    1. 表1に従って、37°Cまたは55°Cの水浴で30分間インキュベートすることにより、脂質をMαCDにロードします。選択する温度は、選択した脂質のゲル-液相融点より高くなければなりません。メディアは曇りから晴れのようになります。
    2. 脂質交換培地を室温まで30〜60分間冷却します。

4. 細胞の脂質交換処理

  1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、300 μg/mL L-グルタミン、100 μg/mL L-グルタミン、100 μg/mL 非必須アミノ酸、50 μg/mL G418、2 μM メトトレキサート、および1x 抗生物質-抗真菌薬を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、4.5 g/L グルコース)で 37 °C および 5 % CO2 で CHO IR 細胞を増殖します。
    1. 1.5 x 106 セルを60 mmプレートに播種し、80%〜90%がコンフルエントになるまで成長させます。
    2. PBS1 mLを加えて細胞を3回洗浄し、吸引します。2 mLの無血清ハムF12培地で細胞を一晩飢餓状態にします。
  2. 細胞を1mLのPBSで3回洗浄します。調製した交換培地または無血清培地1 mLをコントロールとして細胞に加え、室温(25°C-27°C)で1時間インキュベートします。15分ごとに細胞を渦巻き、交換培地に均一に曝露します。
    1. 細胞を1mLのPBSで3回洗浄します。その後、各プレートは、ステップ5で脂質抽出のために、またはステップ7でIR自己リン酸化のために処理することができます。

5. 細胞培養プレート上での脂質抽出

  1. PBSを完全に取り除き、プレートを45°の角度で10分間または完全に乾くまでセットし、底部に溜まる可能性のあるバッファーを取り除きます。
  2. 乾燥細胞に3:2(v:v)ヘキサン:イソプロパノール溶液1 mLを加え、室温のシェーカーで10分間インキュベートします。
  3. 溶液をホウケイ酸チューブに移します。テフロンテープで覆い、-20°Cで保存します。
  4. 1N NaOHを500 μL加え、室温で10分間振とうして、残りの細胞破片を溶解します。
    1. この溶液をBradford Assayなどのタンパク質定量アッセイで使用して、各サンプルのタンパク質濃度を測定します。これらの濃度値を使用して、HP-TLCプレート上の脂質抽出物のロード量を正規化し、すべてのサンプルで脂質負荷を均等にすることができます。

6. HP-TLCによる交換効率の確認

  1. 65:25:5 (v:v:v) クロロホルム:メタノール:30% (v/v) 水酸化アンモニウム 100 mL を作製し、ガラス製の TLC タンクに注ぎます。しっかりと覆い、蒸気が少なくとも1時間平衡化するのを待ちます。
  2. 脂質抽出物サンプルを、N2 ガスの流れの下で低温設定の加熱ブロック上で乾燥させ、すべての見かけの有機溶媒が蒸発するまで加熱します。
  3. 脂質フィルムを1:1(v:v)クロロホルム:メタノールの50μLに溶解します。
  4. 10 μL の Hamilton シリンジを使用して、1 cm バンドで 1-10 μL のサンプルをシリカ HP-TLC プレートにロードします。20cmのプレートに最大10本のバンドをセットします。正規化された値を使用して、すべてのサンプルで同量の脂質をロードするために必要な容量を決定します。
    注:各サンプルをロードする前に、プレートを中高設定のホットプレートに置いてアクティブにする必要があります。
  5. プレートを直立させてTLCタンクに置き、溶媒の前面を8 cm移動させて、リン脂質種を確実に分離します。
  6. プレートを10分間乾かします。3%(w / v)酢酸銅と8%(v / v)リン酸の水溶液をスプレーします。
    1. プレートを室温またはヒートガンで30分間乾燥させます。プレートが半透明の青から不透明な白に変わります。
  7. 180°C〜200°Cのオーブンで5〜10分間、または黒い脂質バンドが検出されるまでプレートを焦がします。

7. 自己リン酸化アッセイとウェスタンブロットによる受容体活性化のチェック

  1. 500 μL の 100 nM インスリンと 500 μL の細胞を無血清培地で室温で 5 分間インキュベートします。
  2. 氷冷したPBSで細胞を洗浄し、細胞を氷の上に置いて刺激を止めます。氷冷したPBS1 mLを速やかに細胞に加え、セルスクレーパーで回収します。細胞を3000 x g で5分間、4°Cでペレット化します。
  3. 100-200 μLの完全RIPA溶解バッファー(50 mM Tris pH 8、200 mM NaCl、1 mM EDTA、1% (v/v) Triton X-100、1% (w/v) デオキシコール酸ナトリウム、1 mM活性オルトバナジンナトリウム、10 μg/mLアプロチニン、10 μg/mLロイペプチン)を氷上の細胞ペレットに加えます。ピペットで上下に30〜40回動かして溶解します。
  4. ライセートを氷上で10分間インキュベートします。細胞破片のライセートを透明化するために、16,000 x g で4°Cで10分間遠心し、上清を回収します。約20 μLのライセートをリセートして、Bradfordアッセイでタンパク質濃度を測定します。
  5. ライセートを5x Laemmli バッファー(350 mM Tris HCl pH 6.8、30% v/v グリセロール、10% w/v SDS、25% v/v β-メルカプトエタノール、0.002 g のブロモフェノールブルー)と組み合わせ、95°Cで5分間煮沸します。添加する緩衝液の量は、最終濃度が1x Laemmli 緩衝液に達するのに十分である必要があります。
  6. 溶解物をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)にかけます。
    1. すべてのサンプルについて等量のタンパク質を分子量マーカーとともにSDS-PAGEゲルにロードします。100 V〜150 Vのランニングバッファー(2.5 mM Tris pH 8、19.2 mMグリシン、0.01%(w/v)SDS)で、100〜250 kDaの範囲で十分に分離されるまで実行します。
  7. 転写バッファー(2.5 mM Tris pH 8、19.2 mM グリシン)中のポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに、100 Vおよび4 °Cで1時間移します。
  8. TBST(50 mM Tris pH 8、150 mM NaCl、0.1%(v/v)Tween 20)中の5% BSA溶液中で、PVDFメンブレンを室温で30分間ブロックします。
  9. pYpY IR抗体またはIR-β抗体と、TBST中の5% BSA溶液中濃度1:1000で室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
    注:pYpY IR抗体は、リン酸化チロシン1162および1163を特異的に認識し、受容体の自己リン酸化を示す役割を果たします。IR-β抗体は、リン酸化状態に関係なく、受容体のベータサブユニットを無差別に認識し、受容体の全体的なレベルを示す役割を果たします。
  10. TBSTで室温で3回洗浄します。α Rabbit-HRP抗体とTBST中の1% BSA溶液中濃度1:3000で室温で30分間インキュベートします。
  11. TBSTで室温で3回洗浄します。強化化学発光(ECL)基質と1分間インキュベートし、フィルムをイメージングします。

結果

交換後の細胞脂質組成の観察可能な変化を実証するために、脳SM(bSM)および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)交換後のCHO IR細胞でHP-TLCを実施しました(図1)。bSMのようなスフィンゴミエリンが交換に使用されている場合、SMバンド強度の増加が明らかであり、未処理のコントロールと比較してPCバンド強度の減少が見られます。逆に?...

ディスカッション

細胞膜における脂質ラフトの存在が概念化されて以来、細胞内で脂質ラフトを可視化し、脂質と受容体の関連を研究する試みが数多く行われてきました。細胞における顕微鏡11を含む実験では、蛍光タグ付きバイオマーカー、通常はラフトと会合することが知られているタンパク質および脂質を使用して、細胞12内の秩序化された?...

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

資金はNIHの助成金であるGM 122493によって提供されました。CHO IR細胞は、Jonathan Whittaker博士(Case Western Reserve University)からの親切な贈り物でした。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DLPC)Avanti Polar Lipids850335
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids850345
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids850355
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids850365
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids850457
Anti-insulin receptor β antibodyCell Signaling TechnologyCST3025
Anti-pYpY1162/1163 Insulin receptor antibodyR&D Systems Inc.AF2507
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074
Borosilicate glass test tubes (12 x 75 mm)Thermo Fisher Scientific14-961-26
Brain sphingomyelin (bSM)Avanti Polar Lipids860062
Egg sphingomyelin (eSM)Avanti Polar Lipids860061
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-016-CV
G418 disulfate saltSigma AldrichA1720
Gibco Antibiotic-antimycotic solution (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Gibco Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate)Thermo Fisher Scientific11965092
Gibco ham’s F12 mediaThermo Fisher Scientific11765054
Gibco L-glutamineThermo Fisher Scientific25030032
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140050
Gibco phosphate buffered saline (PBS) without calcium and magnesium (0.144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0.795 g/L Na2- HPO4 (anhydrous))Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300054
High performance thin layer chromatography (HP-TLC)MerckHP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF MembraneMilliporeIPVH00010
MethotrexateSigma Aldrich454126
Methyl-α-cyclodextrin (MαCD)AraChemCDexA076/BR
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermo Fisher Scientific32106
Sodium orthovanadate, ActivatedSigma Aldrich5.08605

参考文献

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