蛋白质抗原对羊的免疫和抗原特异性单域抗体的制备

我们在这里描述的方法由我们的NIH COBRE赞助，肯塔基大学蛋白质核心设施采用，以帮助研究人员在羊驼中产生单域抗体。单域抗体是回答生物医学研究中关键问题的重要工具。我们演示的技术的主要优点是，它允许在单个羊驼中生产多达五种不同蛋白质的单域抗体。

这项技术的影响延伸到人类健康和疾病治疗，因为这些单域抗体可以用作治疗，疫苗和诊断。对于大多数成熟的生物医学研究者来说，最重要的障碍是处理大型动物，如羊驼。处理羊驼、注射抗原和采集血液的视觉演示对于这些骆驼体中单域抗体的成功生产至关重要。

演示该程序将是杰夫·斯迈利医生，大学兽医，凯西·博阿兹女士，兽医技术员，和艾琳·琼斯女士，实验室动物技术员。研究助理赵马丁博士将演示血液的处理。这组作品的真实故事是蓝眼睛，大男孩，或亲切地被称为大猩猩，和弗雷迪，我们的肯塔基羊驼。

首先，用吊带和铅约束动物。然后修剪羊驼的头发与电动剪子在一个新月图案沿它的脖子底部，从肩到肩。小心地握住羊驼的头部和颈部，沿着颈部底部，在弓淋巴结附近，用22个量表针慢慢注射抗原皮。

进行五次注射，每次约200微升，相距约5厘米。在此之后，监测动物约20分钟，以寻找过敏的迹象。每周检查注射部位的局部炎症。

要抽血，请夹住羊驼的头发，用酒精拭子对采集地点进行消毒。轻轻地抑制羊驼，确保颈部保持直立和直。利用椎骨横向过程的腹体投影作为里程碑，通过向腹体过程施加内向压力来遮挡静脉。

接下来，以 45 度角插入针头，稍微向投影中，朝向颈部中心。操纵针头，直到血液流动。首先，用5毫升PBS稀释15毫升的采集血液。

然后，移液器血液进入淋巴细胞分离管，通过密度梯度离心分离外周血淋巴细胞（PBL）。轻轻取出顶部等离子层，将其保存在单独的管中。然后，轻轻去除PBL层，并将其转移到无菌的50毫升管。

在 PLL 中加入 45 毫升预冷却 PBS，在 800 倍 G 和 4 摄氏度下旋转管管 20 分钟。用移液器去除上流液，留下含有淋巴细胞的颗粒。再用五毫升预冷却的 PBS 清洗颗粒两次，为 RNA 分离做好准备。

利用此协议，针对一系列蛋白质抗原生成单域抗体。免疫监测表明，大多数抗原从三周开始表现出强健反应，获得血液的最佳时间是六周。对阳性菌落的测序确定了不同抗原的不同单域抗体序列。

例如，三个独特的菌落被分离到参考抗原麦芽糖结合蛋白。一般来说，单域抗体含有显著的序列多样性和抗原结合回路的极可变长度。这些功能在单域抗体抗原相互作用中尤为重要。

该程序允许生产单域抗体，每个动物最多生产五种抗原。每个动物都使用单一的血液收集和图书馆结构。利用基于噬菌体显示的选择来识别抗原特异性单链抗体。

在进行抗原注射和血液采样时，重要的是将羊驼留在一组，使它们更平静。这可以使用吊带和引线完成，并在过程中将它们紧密地绑在一起。