Die Methoden, die wir hier beschreiben, wurden von unserem nIH COBRE gesponserten, University of Kentucky Protein Core Facility übernommen, um Forschern zu helfen, Einzel-Domänen-Antikörper in Alpakas zu produzieren. Einzel-Domänen-Antikörper sind ein wichtiges Instrument, um Schlüsselfragen in der biomedizinischen Forschung zu beantworten. Der Hauptvorteil der Von uns demonstrierten Techniken besteht darin, dass sie die Produktion von Einzeldomänen-Antikörpern an bis zu fünf verschiedene Proteine in einem einzigen Alpaka ermöglichen.
Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die menschliche Gesundheit und die Behandlung von Krankheiten, da diese ein-Domänen-Antikörper als Therapeutika, als Impfstoffe und als Diagnostik verwendet werden können. Die größte Hürde für die meisten etablierten biomedizinischen Forscher ist der Umgang mit großen Tieren wie dem Alpaka. Visuelle Demonstration des Umgangs mit einem Alpaka, die Injektion von Antigenen, und die Sammlung von Blut, sind entscheidend für die erfolgreiche Produktion von Ein-Domänen-Antikörper in diesen Kameliden.
Demonstriert wird das Verfahren von Doktor Jeff Smiley, Universitätstierärztin, Frau Kathy Boaz, Veterinärtechnikerin, und Frau Erin Jones, Labortiertechnikerin. Der Umgang mit dem Blut wird von Doktor Martin Chao, Research Associate, demonstriert. Die wahren Geschichten dieser Produktion sind Blue Eyes, Big Boy oder liebevoll als Gorilla bekannt, und Freddie, unsere Kentucky Alpakas.
Zunächst halten Sie das Tier mit einem Halfter und Blei. Dann trimmen Sie das Haar des Alpakas mit elektrischen Clippers in einem Halbmondmuster entlang der Basis seines Halses, von Schulter zu Schulter. Halten Sie das Alpaka vorsichtig an Kopf und Hals und injizieren Sie die Antigene langsam subkutan mit einer 22-Meter-Nadel entlang der Basis des Halses, in der Nähe der Lymphknoten des Bogens.
Führen Sie fünf Injektionen von jeweils etwa 200 Mikrolitern durch, die etwa fünf Zentimeter voneinander entfernt sind. Danach, überwachen Sie das Tier für etwa 20 Minuten auf Anzeichen einer Anaphylaxie. Überprüfen Sie die Injektionsstelle wöchentlich auf lokalisierte Entzündungen an den Injektionsstellen.
Um Blut zu ziehen, schneiden Sie die Haare des Alpakas und desinfizieren Sie die Sammelstelle mit Alkoholtupfern. Halten Sie das Alpaka sanft zurück, um sicherzustellen, dass der Hals aufrecht und gerade gehalten wird. Verwenden Sie die ventralen Projektionen des Transverendes der Wirbel als Landmark, verschließen Sie die Vene, indem Sie Druck nur medial auf den ventralen Prozess anwenden.
Als nächstes legen Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel, leicht medial zur Projektion, in Richtung der Mitte des Halses. Manipulieren Sie die Nadel, bis das Blut fließt. Zuerst 15 Milliliter des gesammelten Blutes mit fünf MilliliterPBS verdünnen.
Dann, Pipettenblut in eine Lymphozyten-Trennröhre, um periphere Blutlymphozyten zu isolieren, oder PBLs, über Dichte Gradient Zentrifugation. Entfernen Sie vorsichtig die obere Plasmaschicht und speichern Sie sie in einem separaten Rohr. Entfernen Sie dann vorsichtig die PBL-Schicht und übertragen Sie sie in ein steriles 50-Milliliter-Rohr.
Fügen Sie 45 Milliliter vorgekühlten PBS zu den PBLs hinzu und drehen Sie die Röhre 20 Minuten bei 800 mal G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, so dass das Pellet die Lymphozyten enthält. Waschen Sie das Pellet noch zwei Mal mit fünf Millilitern vorgekühltem PBS, um die PBLs für die RNA-Isolierung vorzubereiten.
Mit diesem Protokoll wurden Einzeldomänen-Antikörper gegen eine Reihe von Proteinantigenen erzeugt. Die Immunüberwachung zeigte, dass die Mehrheit der Antigene ab drei Wochen eine robuste Reaktion zeigte und dass die optimale Zeit, um Blut zu erhalten, bei sechs Wochen liegt. Die Sequenzierung der positiven Kolonien identifizierte verschiedene Einzel-Antikörper-Sequenzen für verschiedene Antigene.
Zum Beispiel wurden drei einzigartige Kolonien zum Referenzantigen Maltose-bindendes Protein isoliert. Im Allgemeinen enthielten die Einzeldomänen-Antikörper eine signifikante Sequenzvielfalt und eine sehr variable Länge von Antigen-Bindungsschleifen. Diese Eigenschaften sind besonders wichtig bei Single-Domain-Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen.
Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung von Einzel-Antikörpern für bis zu fünf Antigene pro Tier. Für jedes Tier wird eine einzige Blutentnahme und Bibliotheksbau genutzt. Mit phagendisplay-basierter Auswahl verwendet, um antigenspezifische, einkettige Antikörper zu identifizieren.
Während der Antigen-Injektionen und Blutentnahme, Es ist wichtig, die Alpakas in einer Gruppe zu halten, die sie ruhiger hält. Dies kann mit Halfter und Leads erfolgen und sie während der Prozeduren in unmittelbarer Nähe binden.
