Les méthodes que nous décrivons ici ont été adoptées par notre nih COBRE parrainé, University of Kentucky Protein Core Facility pour aider les chercheurs à produire des anticorps à domaine unique dans les alpagas. Les anticorps à domaine unique sont un outil important utilisé pour répondre aux questions clés de la recherche biomédicale. Le principal avantage des techniques que nous démontrons est qu’il permet la production d’anticorps à domaine unique jusqu’à cinq protéines distinctes dans un seul alpaga.
Les implications de cette technique s’étendent à la santé humaine et au traitement de la maladie puisque ces anticorps à domaine unique peuvent être utilisés comme thérapeutiques, comme vaccins et comme diagnostics. L’obstacle le plus important pour la plupart des chercheurs biomédicaux établis est la manipulation de gros animaux, comme l’alpaga. La démonstration visuelle de la manipulation d’un alpaga, l’injection d’antigènes, et la collecte de sang, sont critiques pour la production réussie d’anticorps à domaine unique chez ces camélidés.
Le Docteur Jeff Smiley, vétérinaire de l’Université, Mme Kathy Boaz, technicienne vétérinaire, et Mme Erin Jones, technicienne en animaux de laboratoire, feront la démonstration de l’intervention. La manipulation du sang sera démontrée par le Docteur Martin Chao, Associé de Recherche. Les vraies histoires de cette production sont Blue Eyes, Big Boy, ou affectueusement connu comme le gorille, et Freddie, nos alpagas du Kentucky.
Pour commencer, retenez l’animal avec un licol et du plomb. Ensuite, coupez les cheveux de l’alpaga avec des tondeuses électriques dans un motif croissant de lune le long de la base de son cou, de l’épaule à l’épaule. Maintenez soigneusement l’alpaga par la tête et le cou, et injectez lentement les antigènes sous-cutanéement avec une aiguille de calibre 22 le long de la base du cou, près des ganglions lymphatiques avant.
Effectuez cinq injections d’environ 200 microlitres chacune, à environ cinq centimètres l’une de l’autre. Après cela, surveillez l’animal pendant environ 20 minutes pour les signes d’anaphylaxie. Inspecter le site d’injection pour déce faire une inflammation localisée aux sites d’injection chaque semaine.
Pour préséner le sang, couper les cheveux de l’alpaga et désinfecter le site de collecte avec des écouvillons d’alcool. Retenez doucement l’alpaga, en veillant à ce que le cou soit tenu droit et droit. En utilisant les projections ventrales du processus transversaux des vertèbres comme point de repère, occlusez la veine en appliquant une pression juste médiale au processus ventral.
Ensuite, insérez l’aiguille à un angle de 45 degrés, légèrement médial à la projection, vers le centre du cou. Manipuler l’aiguille jusqu’à ce que le sang coule. Tout d’abord, diluer 15 millilitres du sang recueilli avec cinq millilitres de PBS.
Ensuite, pipette sang dans un tube de séparation des lymphocytes pour isoler les lymphocytes sanguins périphériques, ou PBLs, par centrifugation gradient de densité. Retirez délicatement la couche plasma supérieure, en la sauvant dans un tube séparé. Ensuite, retirez doucement la couche PBL et transférez-la dans un tube stérile de 50 millilitres.
Ajouter 45 millilitres de PBS pré-refroidi aux PBLs et faire tourner le tube pendant 20 minutes à 800 fois G, et quatre degrés Celsius. Retirer le supernatant à l’avec une pipette, en laissant la pastille contenant les lymphocytes. Lavez la pastille deux fois de plus avec cinq millilitres de PBS pré-refroidi pour préparer les PBLs pour l’isolement de l’ARN.
En utilisant ce protocole, des anticorps à domaine unique ont été générés contre une gamme d’antigènes protéiques. La surveillance immunitaire a indiqué que la majorité des antigènes ont montré la réponse robuste commençant à trois semaines, et que le moment optimal pour obtenir le sang est à six semaines. Le séquençage des colonies positives a permis d’identifier diverses séquences d’anticorps à domaine unique pour différents antigènes.
Par exemple, trois colonies uniques ont été isolées à la protéine de référence antigène liant la maltose. En général, les anticorps à domaine unique contenaient une grande diversité de séquences et une longueur très variable de boucles liant les antigènes. Ces caractéristiques sont particulièrement importantes dans les interactions anticorps anticorps à domaine unique.
Cette procédure permet la production d’anticorps à domaine unique pour un jusqu’à cinq antigènes par animal. Une seule collecte de sang, et la construction de la bibliothèque, est utilisée pour chaque animal. Avec la sélection basée sur l’affichage des phages utilisée pour identifier les anticorps à chaîne unique spécifiques aux antigènes.
Tout en faisant les injections d’antigène et l’échantillonnage du sang, il est important de garder les alpagas dans un groupe, ce qui les maintient plus calmes. Cela peut être fait à l’aide de licols et de fils, et de les léchage à proximité pendant les procédures.
