우리가 여기에서 설명하는 방법은 연구원이 알파카에 있는 단 하나 도메인 항체를 생성하는 것을 돕기 위하여 켄터키 단백질 코어 시설의 대학 후원한 우리의 NIH COBRE에 의해 채택되었습니다. 단일 도메인 항체는 생물 의학 연구에서 주요 질문에 대답하는 데 사용되는 중요한 도구입니다. 우리가 보여주는 기술의 주요 장점은 단일 알파카에서 최대 5개의 뚜렷한 단백질까지 단일 도메인 항체의 생산을 허용한다는 것입니다.
이 기술의 의미는 이 단 하나 도메인 항체가 치료로, 백신으로, 및 진단으로 사용될 수 있기 때문에 인간 건강 및 질병 처리로 확장됩니다. 대부분의 확립 된 생물 의학 조사자에게 가장 중요한 장애물은 알파카와 같은 큰 동물을 처리하는 것입니다. 알파카를 처리하는 시각적 데모, 항원 의 주입 및 혈액 수집은 이러한 낙타에서 단일 도메인 항체의 성공적인 생산에 매우 중요합니다.
절차를 시연하는 것은 닥터 제프 스마일리, 대학 수의사, Ms.Kathy Boaz, 수의학 기술자 및 실험실 동물 기술자인 에린 존스(Erin Jones) 씨가 될 것입니다. 혈액의 처리는 닥터 마틴 차오, 연구 동료에 의해 입증될 것입니다. 이 작품의 진짜 이야기는 블루 아이즈, 빅 보이, 또는 고릴라로 애정으로 알려진, 프레디, 우리의 켄터키 알파카입니다.
먼저 동물을 홀터로 제지하고 납으로 보호합니다. 그런 다음 알파카의 머리카락을 어깨에서 어깨까지 목 의 베이스를 따라 초승달 패턴의 전기 클리퍼로 다듬습니다. 머리와 목에 의해 알파카를 조심스럽게 잡고, 활 림프절 근처, 목의 베이스를 따라 22 게이지 바늘로 항원을 천천히 주입한다.
약의 5 개의 주사를 수행 200 마이크로 리터 각, 약 5 센티미터 떨어져. 그 후, 아나필락시스의 징후는 약 20분 동안 동물을 모니터링한다. 매주 주사 부위에서 국소화된 염증에 대한 주사 부위를 검사합니다.
혈액을 뽑기 위해 알파카의 머리카락을 잘라내고 수집 부위를 알코올 면봉으로 소독합니다. 알파카를 부드럽게 억제하여 목이 똑바로 세워지도록 합니다. 척추의 횡방향 과정의 복부 투영을 랜드마크로 사용하여 복부 공정에 내측 압력을 가하여 정맥을 폐색합니다.
다음으로 바늘을 45도 각도로 삽입하고, 돌출에 약간 내다보고, 목의 중심을 향해 한다. 혈액이 흐를 때까지 바늘을 조작합니다. 첫째, PBS의 5 밀리리터와 수집 된 혈액의 15 밀리리터를 희석.
그런 다음, 파이펫 혈액을 림프구 분리 튜브로 분리하여 밀도 그라데이션 원심분리를 통해 말초 혈액 림프구 또는 PBL을 분리합니다. 상단 플라즈마 층을 부드럽게 제거하여 별도의 튜브에 저장합니다. 그런 다음 PBL 층을 부드럽게 제거하고 멸균 50 밀리리터 튜브로 옮김합니다.
45밀리리터의 미리 차가운 PBS를 PBL에 넣고 800회 G, 섭씨 4도에서 20분 동안 튜브를 회전시합니다. 파이펫으로 상체를 제거하고 림프구가 들어있는 펠릿을 남깁니다. 미리 냉각된 PBS 5밀리리터로 펠릿을 2회 더 세척하여 RNA 절연을 위한 PBL을 준비합니다.
이 프로토콜을 사용하여, 단하나 도메인 항체는 단백질 항원의 범위에 대하여 생성되었다. 면역 모니터링은 항원의 대다수가 3 주에서 시작하여 강력한 반응을 보였으며 혈액을 얻는 최적의 시간은 6 주임을 나타냅니다. 양성 식민지를 염시퀀싱하여 상이한 항원용 다양한 단일 도메인 항체 서열을 확인했습니다.
예를 들어, 3개의 독특한 콜로니는 기준 항원 말토제 결합 단백질에 격리되었다. 일반적으로, 단일 도메인 항체는 항원 결합 루프의 상당한 서열 다양성 및 매우 가변적인 길이를 포함했다. 이러한 특징은 단일 도메인 항체 항원 상호 작용에서 특히 중요합니다.
이 절차는 동물 당 최대 5 개의 항원에 대한 단일 도메인 항체의 생산을 허용합니다. 단일 혈액 수집 및 도서관 구조는 각 동물에 대해 활용됩니다. 항원 특이적 단일 체인 항체를 식별하기 위해 파지 디스플레이 기반 선택으로 활용.
항원 주사와 혈액 샘플링을하는 동안, 그(것)들을 진정시키는 단에 있는 알파카를 유지하는 것이 중요합니다. 이 작업은 홀터와 리드를 사용하여 수행할 수 있으며 절차 중에 가까운 곳에 묶을 수 있습니다.
