ここで説明する方法は、研究者がアルパカで単一ドメイン抗体を産生するのを助けるために、NIH COBRE主催のケンタッキー大学プロテインコア施設によって採用されました。単一ドメイン抗体は、生物医学研究における重要な質問に答えるために使用される重要なツールです。我々が実証する技術の主な利点は、単一のアルパカ内で最大5つの異なるタンパク質に単一ドメイン抗体を産生できることである。
これらの単一ドメイン抗体は、治療薬として、ワクチンとして、そして診断として使用することができるので、この技術の意味は、人間の健康と疾患治療に及ぶ。最も確立された生物医学研究者にとって最も重要なハードルは、アルパカのような大型動物の取り扱いです。アルパカの取り扱い、抗原の注入、血液の採取の視覚的実証は、これらのラクダ中の単一ドメイン抗体の産生を成功させるために重要である。
この手順のデモンストレーションは、ジェフ・スマイリー博士、大学獣医、キャシー・ボアズ氏、獣医技術者、エリン・ジョーンズさん(ラボ動物技術者)です。血液の取り扱いは、ドクター・マーティン・チャオ、リサーチアソシエイトによって実証されます。この作品の本当の物語は、ブルーアイズ、ビッグボーイズ、または愛情を込めてゴリラとして知られている、とフレディ、私たちのケンタッキー州のアルパカです。
まず、ホルターとリードで動物を拘束します。その後、肩から肩まで、首のベースに沿って三日月のパターンで電気バリカンでアルパカの髪をトリミングします。頭頸部でアルパカを慎重に保持し、首の基部に沿って、弓リンパ節の近くに22ゲージ針を用いて皮下にゆっくりと抗原を注入する。
約200マイクロリットル、約5センチメートル離れて5回の注射を行います。この後、アナフィラキシーの兆候について約20分間動物を監視します。注射部位の局所的な炎症を毎週注射部位で検査する。
血液を引き出すために、アルパカの髪をクリップし、アルコール綿棒でコレクションサイトを消毒します。アルパカを軽く拘束し、首が直立してまっすぐに保持されるようにします。脊椎の横方向のプロセスの腹側の投影をランドマークとして使用して、腹側プロセスにちょうど内側の圧力を適用することによって静脈を閉塞させる。
次に、針を45度の角度で挿入し、突起にわずかに内側を向き、首の中心に向かって挿入する。血液が流れるまで針を操作します。まず、採取した血液の15ミリリットルを5ミリリットルのPBSで希釈する。
次いで、ピペットの血液をリンパ球分離チューブに入れ、密度勾配遠心分離を介して末梢血リンパ球、またはPDLを単離する。上のプラズマ層を静かに取り外し、別のチューブに保存します。次にPBL層を軽く取り出し、滅菌50ミリリットルチューブに移します。
PPBに45ミリリットルの冷蔵PBSを加え、800倍Gで20分間、摂氏4度でチューブを回転させます。上清をピペットで取り出し、リンパ球を含むペレットを残します。ペレットを5ミリリットルのプレチルドPBSでさらに2回洗浄し、RNA分離のためのPMLを準備します。
このプロトコルを用いて、一ドメイン抗体は、タンパク質抗原の範囲に対して生成された。免疫モニタリングは、抗原の大半が3週から始まる堅牢な応答を示し、血液を得るのに最適な時間が6週間であることを示した。正のコロニーをシーケンシングすると、異なる抗原に対する多様な単一ドメイン抗体配列が同定された。
例えば、3つのユニークなコロニーを、参照抗原マルトース結合タンパク質に単離した。一般に、単一ドメイン抗体は、抗原結合ループの有意な配列多様性および非常に可変長を含んでいた。これらの特徴は、単一ドメイン抗体抗原相互作用において特に重要である。
この手順により、1匹の動物につき最大5つの抗原に対する単一ドメイン抗体の産生が可能になります。単一の採血、およびライブラリーの構造は、各動物のために利用される。ファージディスプレイベースの選択により、抗原特異的な単鎖抗体を同定するために利用される。
抗原注射と血液サンプリングを行っている間、アルパカをグループに保つことが重要であり、彼らを穏やかに保ちます。これは、ホルターとリードを使用して行い、手順中に近接してそれらを結び付けることができます。
