I metodi che descriviamo qui sono stati adottati dal nostro NIH COBRE sponsorizzato, University of Kentucky Protein Core Facility per aiutare i ricercatori a produrre anticorpi monodominio in alpaca. Gli anticorpi monodominio sono uno strumento importante utilizzato per rispondere alle domande chiave nella ricerca biomedica. Il principale vantaggio delle tecniche che dimostriamo è che consente la produzione di anticorpi monodominio fino a cinque proteine distinte in una singola alpaca.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla salute umana e al trattamento delle malattie poiché questi anticorpi monodominio possono essere usati come terapie, come vaccini e come diagnostica. L'ostacolo più significativo per la maggior parte degli investigatori biomedici affermati è la gestione di animali di grandi dimensioni, come l'alpaca. La dimostrazione visiva della manipolazione di un alpaca, l'iniezione di antigeni e la raccolta del sangue sono fondamentali per il successo della produzione di anticorpi monodominio in questi camelidi.
A dimostrare la procedura saranno il dottor Jeff Smiley, veterinario universitario, la signora Kathy Boaz, tecnico veterinario, e la signora Erin Jones, tecnico di animali da laboratorio. La manipolazione del sangue sarà dimostrata dal Dottor Martin Chao, Research Associate. Le storie reali di questa produzione sono Blue Eyes, Big Boy, o affettuosamente conosciuto come gorilla, e Freddie, i nostri alpaca del Kentucky.
Per iniziare, trattenere l'animale con una cavezza e piombo. Quindi tagliare i capelli dell'alpaca con tosaerba elettriche in un motivo lunare a mezzaluna lungo la base del collo, da spalla a spalla. Tenere con cura l'alpaca per la testa e il collo e iniettare lentamente gli antigeni per via sottocutanea con un ago calibro 22 lungo la base del collo, vicino ai linfonodi di prua.
Eseguire cinque iniezioni di circa 200 microlitri ciascuna, distanti circa cinque centimetri l'una dall'altra. Dopo questo, monitorare l'animale per circa 20 minuti per i segni di anafilassi. Ispezionare il sito di iniezione per l'infiammazione localizzata nei siti di iniezione settimanalmente.
Per disegnare sangue, ritagliare i capelli dell'alpaca e disinfettare il sito di raccolta con tamponi di alcol. Trattenere delicatamente l'alpaca, assicurando che il collo sia tenuto in posizione verticale e dritta. Usando le proiezioni ventrali del processo trasversale delle vertebre come punto di riferimento, oclude la vena applicando pressione solo mediale al processo ventrale.
Quindi, inserire l'ago con un angolo di 45 gradi, leggermente mediale alla proiezione, verso il centro del collo. Manipolare l'ago fino a quando il sangue scorre. In primo luogo, diluire 15 millilitri del sangue raccolto con cinque millilitri di PBS.
Quindi, pipettare il sangue in un tubo di separazione dei linfociti per isolare i linfociti del sangue periferici, o PBL, attraverso la centrifugazione del gradiente di densità. Rimuovere delicatamente lo strato di plasma superiore, salvandolo in un tubo separato. Quindi, rimuovere delicatamente lo strato PBL e trasferirlo in un tubo sterile da 50 millilitri.
Aggiungere 45 millilitri di PBS pre-refrigerato ai PBL e ruotare il tubo per 20 minuti a 800 volte G e quattro gradi Celsius. Rimuovere il supernatante con una pipetta, lasciando il pellet contenente i linfociti. Lavare il pellet altre due volte con cinque millilitri di PBS pre-refrigerato per preparare i PBL per l'isolamento dell'RNA.
Utilizzando questo protocollo, gli anticorpi a dominio singolo sono stati generati contro una serie di antigeni proteici. Il monitoraggio immunitario ha indicato che la maggior parte degli antigeni ha mostrato una risposta robusta a partire da tre settimane e che il momento ottimale per ottenere il sangue è di sei settimane. Sequenziando le colonie positive hanno identificato diverse sequenze di anticorpi monodominio per diversi antigeni.
Ad esempio, tre colonie uniche sono state isolate dalla proteina antigene di riferimento legante il maltosio. Generalmente, gli anticorpi a dominio singolo contenevano una significativa diversità di sequenza e una lunghezza altamente variabile dei loop di legame degli antigeni. Queste caratteristiche sono particolarmente importanti nelle interazioni con l'antigene anticorpale a dominio singolo.
Questa procedura consente la produzione di anticorpi monodominio per un massimo di cinque antigeni per animale. Una singola raccolta di sangue e la costruzione della biblioteca vengono utilizzate per ogni animale. Con la selezione basata sul display del fago utilizzata per identificare anticorpi a catena singola specifici dell'antigene.
Durante le iniezioni di antigene e il prelievo di sangue, è importante mantenere gli alpaca in gruppo, il che li mantiene più calmi. Questo può essere fatto usando fermi e cavi e legandoli nelle immediate vicinanze durante le procedure.
