تم اعتماد الأساليب التي وصفناها هنا من قبل NIH COBRE برعاية، جامعة كنتاكي بروتين مرفق الأساسية لمساعدة الباحثين على إنتاج الأجسام المضادة ذات المجال الواحد في الألبكة. الأجسام المضادة ذات النطاق الواحد هي أداة مهمة تستخدم للإجابة على الأسئلة الرئيسية في البحوث الطبية الحيوية. الميزة الرئيسية للتقنيات التي نثبتها هي أنها تسمح بإنتاج الأجسام المضادة ذات المجال الواحد إلى ما يصل إلى خمسة بروتينات متميزة في الألبكة الواحدة.
وتمتد آثار هذه التقنية لتشمل صحة الإنسان وعلاج الأمراض، حيث يمكن استخدام هذه الأجسام المضادة ذات النطاق الواحد كعلاجات، وكلقاحات، وكتشخيص. العقبة الأكثر أهمية بالنسبة لمعظم المحققين الطب الحيوي راسخة هو التعامل مع الحيوانات الكبيرة، مثل الألبكة. المظاهرة البصرية للتعامل مع الألبكة ، وحقن المستضدات ، وجمع الدم ، أمر بالغ الأهمية لإنتاج ناجح للأجسام المضادة ذات المجال الواحد في هذه الكاوليدات.
وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور جيف سمايلي، طبيب بيطري في الجامعة، والسيدة كاثي بواز، فني بيطري، والسيدة إيرين جونز، فني الحيوانات مختبر. التعامل مع الدم سوف يظهر من قبل الطبيب مارتن تشاو، باحث مشارك. القصص الحقيقية لهذا الإنتاج هي العيون الزرقاء ، بيغ بوي ، أو المعروف بمودة باسم الغوريلا ، وفريدي ، لدينا الألبكة كنتاكي.
للبدء، كبح جماح الحيوان مع الرستر والرصاص. ثم تقليم الشعر الألبكة مع مقصات كهربائية في نمط القمر الهلال على طول قاعدة انها الرقبة، من الكتف إلى الكتف. أمسك الألبكة بعناية من الرأس والرقبة ، وحقن مستضدات تحت الجلد ببطء بإبرة قياس 22 على طول قاعدة الرقبة ، بالقرب من العقد الليمفاوية القوسية.
إجراء خمس حقن من حوالي 200 ميكرولترات لكل من, حوالي خمسة سنتيمترات بعيدا. بعد ذلك ، راقب الحيوان لمدة 20 دقيقة للحصول على علامات الحساسية المفرطة. تفقد موقع الحقن لالتهاب المترجمة في مواقع الحقن أسبوعيا.
لرسم الدم، قص الشعر الألبك وتطهير موقع جمع مع مسحات الكحول. كبح جماح الألبكة بلطف، وضمان أن يتم عقد الرقبة تستقيم ومستقيمة. باستخدام الإسقاطات البطينية للعملية العرضية من الفقرات كمعلم، وانس بين الوريد عن طريق تطبيق الضغط فقط الوسيطة لعملية البطينية.
بعد ذلك ، أدخل الإبرة بزاوية 45 درجة ، وسطية قليلاً إلى الإسقاط ، نحو مركز الرقبة. عالج الإبرة حتى يتدفق الدم. أولاً، تمييع 15 ملليلتر من الدم الذي تم جمعه بخمسة ملليلترات من برنامج تلفزيوني.
ثم, الدم ماصة في أنبوب الفصل اللمفاوية لعزل الخلايا الليمفاوية في الدم الطرفية, أو PBLs, عن طريق الطاردة المركزية كثافة الانحدار. قم بإزالة طبقة البلازما العلوية بلطف، مما يوفرها في أنبوب منفصل. ثم، إزالة بلطف طبقة PBL، ونقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر معقمة.
إضافة 45 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مبردة مسبقا إلى PBLs وتدور الأنبوب لمدة 20 دقيقة في 800 مرة G، وأربع درجات مئوية. إزالة المابس مع ماصة، وترك بيليه تحتوي على الخلايا الليمفاوية. غسل بيليه مرتين أكثر مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني ما قبل المبردة على استعداد PBLs لعزلة الحمض النووي الريبي.
باستخدام هذا البروتوكول، تم إنشاء الأجسام المضادة ذات المجال الواحد ضد مجموعة من مستضدات البروتين. وأشارت المراقبة المناعية إلى أن غالبية المستضدات أظهرت استجابة قوية تبدأ في ثلاثة أسابيع، وأن الوقت الأمثل للحصول على الدم هو في ستة أسابيع. تحديد تسلسل المستعمرات الإيجابية متنوعة تسلسل الأجسام المضادة ذات المجال الواحد لمستضدات مختلفة.
على سبيل المثال، تم عزل ثلاث مستعمرات فريدة من نوعها إلى البروتين المالوسي المرجعي الملزم. بشكل عام، تحتوي الأجسام المضادة ذات المجال الواحد على تنوع تسلسل كبير وطول متغير للغاية من حلقات الربط المستضدي. هذه الميزات مهمة بشكل خاص في مجال واحد مستضد التفاعلات.
يسمح هذا الإجراء بإنتاج الأجسام المضادة ذات النطاق الواحد لما يصل إلى خمسة مستضدات لكل. يتم استخدام مجموعة دم واحدة ، وبناء المكتبة ، لكل. مع اختيار قائم على الشاشة phage المستخدمة لتحديد مستضد محددة، الأجسام المضادة سلسلة واحدة.
أثناء القيام بحقن المستضد وأخذ عينات الدم ، من المهم الحفاظ على الألبكة في مجموعة ، مما يبقيها أكثر هدوءًا. ويمكن القيام بذلك باستخدام الرّواز والدلّل، واتّّهم على مقربة من الإجراءات.
