השיטות שאנו מתארים כאן אומצו על ידי NIH COBRE בחסות NIH שלנו, אוניברסיטת קנטאקי חלבון ליבה מתקן כדי לעזור לחוקרים לייצר נוגדנים חד תחום באלפקות. נוגדנים חד-תחומיים הם כלי חשוב המשמש למענה על שאלות מפתח במחקר ביו-רפואי. היתרון העיקרי של הטכניקות שאנו מדגימים הוא שהיא מאפשרת ייצור נוגדנים חד-תחומיים עד חמישה חלבונים נפרדים באלפקה אחת.
ההשלכות של טכניקה זו חלות על בריאות האדם וטיפול במחלות, שכן נוגדנים חד-תחומיים אלה יכולים לשמש כטיפולים, כחיסונים וכאביון. המכשול המשמעותי ביותר עבור רוב החוקרים הביו-רפואיים המבוססים הוא טיפול בבעלי חיים גדולים, כגון האלפקה. הדגמה חזותית של טיפול באלפקה, הזרקת אנטיגנים ואיסוף דם, הם קריטיים לייצור מוצלח של נוגדנים חד-תחומיים בגמלים אלה.
הדגמת ההליך תהיה ד"ר ג'ף סמיילי, וטרינר אוניברסיטה, גב 'קתי בועז, טכנאי וטרינרי, וגברת ארין ג'ונס, טכנאית חיות מעבדה. טיפול בדם יוכח על ידי ד"ר מרטין צ'או, עמית מחקר. הסיפורים האמיתיים של ההפקה הזו הם עיניים כחולות, ילד גדול, או ידוע בחיבה כגורילה, ופרדי, האלפאקות שלנו בקנטאקי.
כדי להתחיל, לרסן את החיה עם עצירה ועופרת. ואז לקצץ את השיער של האלפקה עם קוצץ חשמלי בתבנית ירח חצי סהר לאורך הבסיס של צווארו, מכתף לכתף. בזהירות להחזיק את האלפקה על ידי הראש והצוואר, ולאט לאט להזריק את האנטיגנים תת עורית עם מחט 22 מד לאורך בסיס הצוואר, ליד בלוטות הלימפה קשת.
בצע חמש זריקות של כ 200 microliters כל אחד, כחמישה סנטימטרים זה מזה. לאחר מכן, לפקח על החיה במשך כ 20 דקות עבור סימנים של אנפילקסיס. בדוק את אתר ההזרקה לדלקת מקומית באתרי ההזרקה מדי שבוע.
כדי למשוך דם, קליפת השיער של האלפקה ולחטא את אתר האוסף עם ספוגיות אלכוהול. לרסן את האלפקה בעדינות, להבטיח כי הצוואר מוחזק זקוף וישר. באמצעות תחזיות הגחון של התהליך הרוחבי של החוליות כציון דרך, occlude את הוריד על ידי הפעלת לחץ רק מתווך לתהליך הגחון.
לאחר מכן, הכנס את המחט בזווית של 45 מעלות, מעט מתווך להקרנה, לכיוון מרכז הצוואר. לתפעל את המחט עד שהדם יזרום. ראשית, לדלל 15 מיליליטר של הדם שנאסף עם חמישה מיליליטר של PBS.
לאחר מכן, דם פיפטה לתוך צינור הפרדת לימפוציטים כדי לבודד לימפוציטים בדם היקפיים, או PBLs, באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות. מוציאים בעדינות את שכבת הפלזמה העליונה, שומרים אותה בצינור נפרד. לאחר מכן, להסיר בעדינות את שכבת PBL, ולהעביר אותו צינור סטרילי 50 מיליליטר.
מוסיפים 45 מיליליטר של PBS מקורר מראש ל- PBLs ומסובבים את הצינור במשך 20 דקות במהירות של פי 800 G וארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant עם פיפטה, משאיר את גלולה המכילה את הלימפוציטים. לשטוף את גלולה פעמיים נוספות עם חמישה מיליליטר של PBS מקורר מראש כדי מוכן PBLs לבידוד RNA.
באמצעות פרוטוקול זה, נוגדנים חד-תחומיים נוצרו כנגד מגוון של אנטיגנים חלבוניים. ניטור המערכת החיסונית הצביע על כך שרוב האנטיגנים הראו תגובה חזקה החל משלושה שבועות, כי הזמן האופטימלי להשיג דם הוא שישה שבועות. רצף המושבות החיוביות זיהה רצפי נוגדנים מגוונים חד-תחומיים לאנטיגנים שונים.
לדוגמה, שלוש מושבות ייחודיות בודדו לחלבון מחייב אנטיגן מלטוז. בדרך כלל, הנוגדנים החד-תחומיים הכילו מגוון רצפים משמעותי ואורך משתנה מאוד של לולאות מחייבות אנטיגן. תכונות אלה חשובות במיוחד באינטראקציות אנטיגן נוגדנים חד-תחומיות.
הליך זה מאפשר ייצור נוגדנים חד-תחומיים עבור עד חמישה אנטיגנים לכל בעל חיים. אוסף דם יחיד, ובניית ספרייה, מנוצל עבור כל בעל חיים. עם בחירה מבוססת תצוגה פאג' מנוצלת לזיהוי נוגדנים ספציפיים לאנטיגן, בעלי שרשרת אחת.
בעת ביצוע זריקות אנטיגן ודגימת דם, חשוב לשמור על האלפקה בקבוצה, אשר שומר אותם רגועים יותר. ניתן לעשות זאת באמצעות עצירות והפניות, וקשירתם בסמיכות במהלך ההליכים.
