Los métodos que describimos aquí fueron adoptados por nuestro NIH COBRE patrocinado, University of Kentucky Protein Core Facility para ayudar a los investigadores a producir anticuerpos de un solo dominio en alpacas. Los anticuerpos de un solo dominio son una herramienta importante que se utiliza para responder a preguntas clave en la investigación biomédica. La principal ventaja de las técnicas que demostramos es que permite la producción de anticuerpos de un solo dominio a hasta cinco proteínas distintas en una sola alpaca.
Las implicaciones de esta técnica se extienden a la salud humana y al tratamiento de enfermedades, ya que estos anticuerpos de un solo dominio pueden utilizarse como terapias, como vacunas y como diagnósticos. El obstáculo más significativo para la mayoría de los investigadores biomédicos establecidos es el manejo de animales grandes, como la alpaca. La demostración visual del manejo de una alpaca, la inyección de antígenos y la acumulación de sangre son fundamentales para la producción exitosa de anticuerpos de un solo dominio en estos camélidos.
Demostrando el procedimiento estarán el Doctor Jeff Smiley, Veterinario De la Universidad, la Sra. Kathy Boaz, Técnico Veterinario, y la Sra. Erin Jones, Técnico de Animales de Laboratorio. El manejo de la sangre será demostrado por el Doctor Martin Chao, Investigador Asociado. Las historias reales de esta producción son Blue Eyes, Big Boy, o cariñosamente conocido como el Gorila, y Freddie, nuestras alpacas de Kentucky.
Para empezar, sujeta al animal con un halter y plomo. Luego recorta el cabello de la alpaca con cortadoras eléctricas en un patrón lunar creciente a lo largo de la base de su cuello, de hombro a hombro. Sostenga cuidadosamente la alpaca por la cabeza y el cuello, e inyecte lentamente los antígenos por vía subcutánea con una aguja de calibre 22 a lo largo de la base del cuello, cerca de los ganglios linfáticos del arco.
Realizar cinco inyecciones de aproximadamente 200 microlitros cada uno, a unos cinco centímetros de distancia. Después de esto, monitoree al animal durante unos 20 minutos en busca de signos de anafilaxia. Inspeccione el lugar de inyección en busca de inflamación localizada en los lugares de inyección semanalmente.
Para extraer sangre, corta el cabello de la alpaca y desinfecta el sitio de recolección con hisopos de alcohol. Sujeta la alpaca suavemente, asegurándote de que el cuello esté erguido y recto. Usando las proyecciones ventrales del proceso transversal de las vértebras como un punto de referencia, ocluir la vena aplicando presión sólo medial al proceso ventral.
A continuación, inserte la aguja en un ángulo de 45 grados, ligeramente medial a la proyección, hacia el centro del cuello. Manipule la aguja hasta que fluya la sangre. Primero, diluir 15 mililitros de sangre recolectada con cinco mililitros de PBS.
Luego, pipetea sangre en un tubo de separación de linfocitos para aislar linfocitos sanguíneos periféricos, o PBL, a través de la centrifugación de gradiente de densidad. Retire suavemente la capa plasmática superior, guardándola en un tubo separado. A continuación, retire suavemente la capa PBL y transfiérala a un tubo estéril de 50 mililitros.
Agregue 45 mililitros de PBS preenfriados a los PBL y gire el tubo durante 20 minutos a 800 veces G y cuatro grados Centígrados. Retire el sobrenadante con una pipeta, dejando el pellet que contiene los linfocitos. Lave el pellet dos veces más con cinco mililitros de PBS pre-refrigerados para preparar los PBL para el aislamiento de ARN.
Con este protocolo, se generaron anticuerpos de un solo dominio contra una gama de antígenos proteicos. El monitoreo inmune indicó que la mayoría de los antígenos mostraron una respuesta robusta a partir de las tres semanas, y que el momento óptimo para obtener sangre es en seis semanas. La secuenciación de las colonias positivas identificó diversas secuencias de anticuerpos de un solo dominio para diferentes antígenos.
Por ejemplo, tres colonias únicas se aislaron a la proteína de unión a la maltosa del antígeno de referencia. Generalmente, los anticuerpos de un solo dominio contenían una diversidad de secuencia significativa y una longitud muy variable de bucles de unión a antígenos. Estas características son particularmente importantes en las interacciones de antígenos de anticuerpos de un solo dominio.
Este procedimiento permite la producción de anticuerpos de un solo dominio para hasta cinco antígenos por animal. Una sola colección de sangre, y la construcción de la biblioteca, se utiliza para cada animal. Con la selección basada en la pantalla del fago utilizada para identificar anticuerpos de cadena única específicos del antígeno.
Mientras se hacen las inyecciones de antígeno y el muestreo de sangre, es importante mantener las alpacas en un grupo, lo que los mantiene más tranquilos. Esto se puede hacer usando halters y leads, y atando en las proximidades durante los procedimientos.
