无偏采样方案对电子显微镜至关重要。如果你想量化它的数字密度突触或其他结构在一定的大脑区域，我们技术的主要优点是，它是公正的，并能够自动产生电子显微图与最小的用户干预。这项技术在其他研究领域也很有价值，如神经科学，可用于评估神经网络的强度。
为了应用我们的协议，有必要在电子显微技术方面有经验，例如样品制备和操作过渡电子显微镜。证明我们的程序将是斯特凡·韦尼茨尼格博士，一个博士后从我的实验室。该协议包括准备大脑样本的电子显微镜，切割对薄部分。
接下来，它将描述如何在感兴趣的区域自动生成一个定义数量的电子显微图。然后，它将使用计数帧来评估结构特征的数值密度。首先，解剖、修复、修复后，并按照随附的文本协议将感兴趣的样本嵌入到嵌入树脂中。
然后，将样品放在超微子上，并产生 55 纳米超薄串行部分。将部分放在一毫米由两毫米的槽网格上，涂有皮奥拉形。然后，使用2%醋酸碱在槽网格上对超薄部分进行30分钟的反面，然后在室温下对铅柠檬酸盐进行30秒的对。
将网格放入 TEM 中，并使用 TEM 使用低放大倍率检查网格上的部分，以定向和评估各部分的质量。然后，启动 TEM 串行剖面软件，选择"剖面"，然后选择"插入"以添加参考和查找部分的角点。按照弹出窗口的说明操作。
从参考部分开始，然后继续查找部分。确保截面的边缘与下一个截面平行，因为输入了第 1 点和 2 点。接下来在低放大率下可视化参考部分，以识别感兴趣的区域。
使用参考部分上的 TEM 图像分析将显微镜阶段移动到 ROI 的多个角点，以创建 ROI 的轮廓。使用随机点采样软件记录生成的多边形的坐标。为此，按"随机点采样"软件对话框中的"添加坐标"，在多边形的每个点上，该点需要勾勒出该节中的 ROI。
接下来，在"随机点采样软件"中定义和输入采样区域和区域之间的距离的合适大小。然后，按"计算栅格"以系统、统一、随机的方式生成微图在多边形中的位置的坐标。使用随机点采样软件和 TEM 串行部分软件将采样点存储在参考和查找部分。
这些是蒙太奇的坐标，随后记录下来。在"随机点采样"软件中，按"转到下一个位置"，将显微镜阶段移动到参考部分中每个采样区域的 x 和 y 坐标。然后，选择"位置"，然后选择"插入"以在参考部分中的 TEM 串行剖面软件中导入这些坐标。
对所有坐标重复此重复。要将参考部分的坐标镜像到查找部分，请选择"剖面"并选择"转到"剖面"。在对话框窗口中输入查找部分的编号。
对于蒙太奇的录制，请如前所述在参考和查找部分之间切换，然后更改参考部分上的位置和数字。选择对话框窗口中的下一个坐标。对于 SerialEM 蒙太奇，在每个采样坐标处，转到"文件"，然后从下拉菜单中选择"新蒙太奇"。
在对话框窗口中选择正确的切片数和重叠百分比。对于本研究，放大5000足以识别研究中的突触特征。但是，CCD相机的视野有限，需要制作两张图像的蒙太奇。
蒙太奇是为串行EM。在录制每个蒙太奇之前，重新调整对焦或激活录制软件中的自动对焦选项。选择文件夹以保存蒙太奇文件，然后按"在序列EM"左侧的蒙太奇子菜单中"开始"开始蒙太奇的录制。
启动微分器，并根据需要定义计数帧的大小和段数。使用解剖器宏计算突触密度。使用工具栏中的多点工具，限制与解剖器的两条禁止线相交的突触，但会计算相反接受线上的突触。
使用椭圆形选择标记计数帧中可见的计数帧中，但在查找部分中不可见的每个突触。对于测量突触参数，请仅选择在参考截面上以横截面为导向的突触切口。这应位于用于解剖器的相同图像帧中。
接下来，转到插件，然后从下拉菜单分析并启动插件 ObjectJ。从 ObjectJ 下拉对话框中打开一个新项目，该对话框将打开一个窗口，允许用户使用标记工具勾勒和标记结构。首先，使用标记工具测量突触前膜的长度和突触后密度长度，沿结构绘制一条线。
然后，通过绘制一个多边形，覆盖突触前膜和突触后膜，获得突触裂口的均宽。要确定停靠的囊泡数量，请计算所有与一个囊泡直径或小于的突触前膜有最大距离的囊泡。然后，通过计算与同一突触的对接或其他未对接囊泡的最大距离为一个囊泡的囊泡，确定未对接囊泡的数量。
该协议的自适应版本允许在超薄部分内无偏见地获得的位置进行元素分析。为此，在 TEM 映像模式下，启动 SerialEM 并打开一个新项目。然后，打开导航器并检查摄像机和脚本控件中摄像机的设置，以便查看和记录和启动视图。
要绘制超薄部分的角图，请选择"导航器"窗口中的"添加点"。然后，在超薄截面的边缘设置角点。按住鼠标右键，将舞台移到拐角点。
到达剖面角时，使用鼠标左键单击添加角点。重复此过程以再添加三个角点。确保在"导航器"窗口中，角点的框 C 为存储点勾选。
要开始角蒙太奇，请转到 SerialEM 菜单栏中的导航器，然后从下拉菜单中选择蒙太基网格和设置角蒙太奇。选择"在导航器"窗口中添加多边形，通过多次鼠标右键单击勾勒出感兴趣的区域。接下来，选择"导航器"下拉菜单中的"添加点网格"，并定义点之间的距离。
启动 EFTEMSerialEM 脚本，按照脚本命令操作，输入导航器中显示的网格点数，然后输入采集点的数量。然后，设置照明阈值，以便脚本可以避免网格条。按照脚本命令手动移动舞台，以覆盖四分之一的网格栏的视野。
根据显示的值，输入高于显示值的阈值照明值。等待，直到选择获取点并完成烹饪程序。这需要很长时间，可以在一夜之间完成。
设置能量过滤 TEM 元素分析后，获取具有元素特定设置的元素映射。无偏采样方法可用于计算和分析特定大脑区域的突触特征。此外，SerialEM 软件的 EFTEMSerialEM 脚本允许人们从整个超薄部分中随机选择采集点，目的是在每个点获得能量过滤电子显微图。
该脚本从标有放坡的点中随机选择多个点，由用户预先定义。通过生成测试显微图并检查其等级级别，脚本检查所选点是否位于部分的可见部分，拒绝落在网格柱上的点。大多数工作流由脚本处理，用户交互最少。
但是，此处显示的示例对于 SerialEM 的自动对焦例程的光线太少。因此，一旦脚本将舞台移到每个点，焦点就被调整，并且用铁制作元素图。必须仔细选择感兴趣的区域，并确保相同数量的采样点属于每个感兴趣的区域。
不要忘记，许多用于标本制备的化学品都是有毒的。因此，请穿实验室外套和防护手套，在烟罩下工作。
