Un protocole d’échantillonnage impartial est essentiel pour la microscopie électronique. Si vous souhaitez le quantifier sur la densité numérique des synapses ou d’autres structures dans une certaine zone du cerveau, le principal avantage de notre technique est qu’elle est impartiale, et permet de produire automatiquement des micrographes électroniques avec une intervention minimale de l’utilisateur. Cette technique est également précieuse dans d’autres domaines de recherche, tels que les neurosciences, où elle peut être utilisée pour évaluer la force d’un réseau neuronal.
Afin d’appliquer notre protocole, il est nécessaire d’avoir de l’expérience dans les techniques microscopiques électroniques, telles que la préparation d’échantillons et l’exploitation d’un microscope électronique de transition. Le Dr Stefan Wernitznig, post-doc de mon laboratoire, démontrera notre procédure. Ce protocole consiste à préparer des échantillons de cerveau pour la microscopie électronique, en coupant des paires de sections minces.
Ensuite, il décrira comment produire automatiquement un nombre défini de micrographes électroniques dans un domaine d’intérêt. Ensuite, il utilisera un cadre de comptage pour évaluer la densité numérique des caractéristiques structurelles. Pour commencer, disséquez, fixez, post-fixez et intégriez des échantillons d’intérêt dans l’intégration de la résine en suivant le protocole texte qui l’accompagne.
Ensuite, placez l’échantillon sur un ultramicrotome et produisez des sections en série ultra minces de 55 nanomètres. Placez les sections sur une grille de fente avec les dimensions d’un millimètre par deux millimètres, recouvertes de forme piola. Ensuite, contrestain les sections ultra minces sur les grilles de fente en utilisant 2% d’acétate d’uranyl pendant 30 minutes, suivie par le citrate de plomb pendant 30 secondes à température ambiante.
Placez la grille dans le TEM et examinez les sections sur la grille avec le TEM à l’aide d’un faible grossissement pour orienter et évaluer la qualité des sections. Ensuite, démarrez le logiciel TEM Serial Section, sélectionnez Section et choisissez Insert pour ajouter les points d’angle pour la section référence et recherche. Suivez les instructions de la fenêtre contexturée.
Commencez par la section de référence, puis continuez avec la section de recherche. Assurez-vous que les bords de la section sont parallèles à la section suivante, car les points un et deux sont entrés. Visualisez ensuite la section de référence sous faible grossissement afin d’identifier la région d’intérêt.
Déplacez l’étape microscope à l’aide de l’analyse d’image TEM sur la section de référence vers plusieurs points d’angle du roi pour créer un contour du retour sur investissement. Enregistrez les coordonnées du polygone résultant à l’aide du logiciel random point sampling. Pour cela, appuyez sur Ajouter des coordonnées dans la boîte de dialogue du logiciel random point sampling à chaque point du polygone qui est nécessaire pour décrire le retour sur investissement dans la section.
Définissez et entrez ensuite une taille appropriée pour les zones d’échantillonnage et les distances entre les zones dans le logiciel d’échantillonnage aléatoire. Ensuite, appuyez sur Calculer Raster pour générer des coordonnées de manière systématique, uniforme et aléatoire pour les positions du micrographe dans le polygone. Stockez les points d’échantillonnage sur les sections de référence et de recherche, à l’aide du logiciel random point sampling et du logiciel TEM Serial Section.
Ce sont les coordonnées des montages qui sont enregistrés par la suite. Dans le logiciel d’échantillonnage aléatoire, appuyez sur passez à la position suivante pour déplacer l’étape du microscope vers les coordonnées x et y de chaque zone d’échantillonnage dans la section de référence. Ensuite, sélectionnez Emplacement et choisissez Insert pour importer ces coordonnées dans le logiciel TEM Serial Section dans la section référence.
Répétez cette demande pour toutes les coordonnées. Pour refléter les coordonnées de la section de référence sur la section de recherche, sélectionnez Section et choisissez Go to Section. Entrez le numéro de la section de recherche dans la fenêtre de dialogue.
Pour l’enregistrement des montages, passez de la section référence et recherche, comme décrit précédemment, et modifiez la position sur la section de référence avec l’emplacement et passez au nombre. Choisissez la coordonnée suivante dans la fenêtre de dialogue. Pour les montages SerialEM, à chaque coordonnée d’échantillonnage, rendez-vous sur File et choisissez Nouveau Montage dans le menu drop-down.
Sélectionnez le bon nombre de tuiles et le pourcentage de chevauchement dans la fenêtre de dialogue. Pour la présente étude, un grossissement de 5000 est suffisant pour reconnaître les caractéristiques synaptiques de l’étude. Mais le champ de vision limité de la caméra CCD nécessitait de faire des montages de deux images sur deux.
Les montages sont réalisés sur SerialEM. Avant d’enregistrer chaque montage, réajuster la mise au point ou activer l’option de mise au point automatique dans le logiciel d’enregistrement. Choisissez le dossier pour enregistrer le fichier montage et commencer l’enregistrement du montage en appuyant sur Démarrer dans le sous-menu montage, à gauche dans SerialEM.
Démarrez le microdissector et définissez la taille du cadre de comptage et le nombre de segments au besoin. Comptez la densité synapse à l’aide de la macroissector. À l’aide de l’outil multi-points situé dans la barre d’outils, limitez les synapses qui se croisent avec les deux lignes interdites duissector, mais comptez les synapses sur les lignes d’acceptation opposées.
Marquez chaque synapse dans le cadre de comptage qui est visible dans la section de référence, mais qui n’est pas visible dans la section de recherche, avec une sélection ovale. Pour mesurer les paramètres synapse, sélectionnez uniquement les synapses avec une fente synaptique orientée en coupe transversale qui se trouve sur la section de référence. Cela doit être dans les mêmes cadres d’image utilisés pour le diffuseur.
Ensuite, allez à Plugins, puis pour analyser et démarrer le plugin ObjectJ à partir du menu drop-down. Ouvrez un nouveau projet à partir du dialogue de drop-down ObjectJ qui ouvrira une fenêtre qui permet à l’utilisateur de décrire et de marquer les structures avec l’outil marqueur. Tout d’abord, utilisez l’outil marqueur pour mesurer la longueur de la membrane présynaptique et la longueur de densité post-synaptique en dessinant une ligne le long de la structure.
Ensuite, obtenez la largeur moyenne de la fente synaptique en dessinant un polygone, couvrant à la fois la membrane pré et post-synaptique. Pour déterminer le nombre de vésicules amarrées, comptez toutes les vésicules qui ont une distance maximale de la membrane présynaptique d’un diamètre de vésicule ou moins. Ensuite, déterminez le nombre de vésicules nonockées en comptant les vésicules avec une distance maximale d’un diamètre vésiculeux des vésicules amarrées ou autres vésicules nonockées à la même synapse.
Une version adaptée du protocole permet des analyses élémentaires à des endroits obtenus impartiaux dans la section ultra mince. Pour cela, en mode imagerie TEM, démarrez SerialEM et ouvrez un nouveau projet. Ensuite, ouvrez le Navigateur et vérifiez les paramètres de la caméra à huis clos et les commandes de script pour la vue et enregistrer et démarrer la vue.
Pour faire une carte d’angle de la section ultra mince, choisissez Ajouter des points dans la fenêtre Navigator. Ensuite, placez les points d’angle sur les bords d’une section ultra mince. Déplacez la scène vers un point d’angle en maintenant la touche de souris droite.
Lorsqu’un coin de la section est atteint, ajoutez un point d’angle avec un clic de souris gauche. Répétez la procédure pour ajouter trois autres points d’angle. Assurez-vous que dans la fenêtre Navigator, la case C pour les points d’angle est cochée pour les points stockés.
Pour commencer le montage d’angle, rendez-vous sur Navigator dans la barre de menu SerialEM et choisissez Montaging Grids et Setup Corner Montage dans le menu drop-down. Choisissez Ajouter polygone dans la fenêtre Navigator et décrire la région d’intérêt avec plusieurs clics de souris à droite. Ensuite, choisissez Ajouter grille de points dans le menu de drop-down Navigator et définir une distance entre les points.
Démarrez le script EFTEMSerialEM, suivez les commandes de script, entrez le nombre de points de grille indiqués dans le Navigateur et entrez le nombre de points d’acquisition. Ensuite, définissez le seuil d’éclairage afin que le script puisse éviter les barres de grille. Suivez les commandes du script et déplacez la scène manuellement pour couvrir le champ de vision d’un quart de la barre de grille.
Selon la valeur affichée, entrez une valeur d’éclairage seuil supérieure à la valeur affichée. Attendez que les points d’acquisition soient sélectionnés et que la routine de cuisson soit terminée. Cela prend beaucoup de temps et peut être fait du jour au lendemain.
Après avoir mis en place pour l’analyse élémentaire TEM filtrée par l’énergie, acquérir une carte élémentaire avec des paramètres spécifiques aux éléments. L’approche d’échantillonnage impartiale est utile pour compter et analyser les caractéristiques synaptiques dans des régions spécifiques du cerveau. En outre, le script EFTEMSerialEM pour le logiciel SerialEM permet de choisir au hasard les points d’acquisition de l’intérieur d’une section ultra mince entière, dans le but d’obtenir un micrographe électronique filtré par l’énergie à chacun de ces points.
Le script a sélectionné au hasard un certain nombre de points, prédéfinie par l’utilisateur à partir de ceux marqués avec un classement. En produisant un micrographe de test et en vérifiant ses niveaux de qualité, le script a vérifié si les points choisis étaient situés sur une partie visible de la section, rejetant les points qui ont atterri sur les barres de grille. La majeure partie du flux de travail a été gérée par le script, avec une interaction minimale de l’utilisateur.
Cependant, avec l’échantillon montré ici, il y avait trop peu de lumière pour la routine de mise au point automatique de SerialEM. Par conséquent, dès que le script a déplacé la scène à chaque point, l’accent a été ajusté et une carte élémentaire a été faite de fer. Il est important de sélectionner soigneusement la région d’intérêt et de s’assurer que le même nombre de points d’échantillonnage se situe dans chaque domaine d’intérêt.
N’oubliez pas que bon nombre des produits chimiques utilisés pour la préparation des échantillons sont toxiques. Portez donc un manteau de laboratoire et des gants de protection et travaillez sous un couvercle de fumée.
