Un protocollo di campionamento imparziale è vitale per la microscopia elettronica. Se si desidera quantificarlo sulla densità numerica delle sinapsi o di altre strutture in una determinata area cerebrale, il vantaggio principale della nostra tecnica è che è imparziale e consente di produrre automaticamente micrografie di elettroni con un intervento minimo da parte dell'utente. Questa tecnica è preziosa anche in altre aree di ricerca, come le neuroscienze, dove può essere utilizzata per valutare la forza di una rete neurale.
Per applicare il nostro protocollo, è necessario avere esperienza nelle tecniche microscopiche degli elettroni, come la preparazione del campione e il funzionamento di un microscopio elettronico di transizione. A dimostrare la nostra procedura sarà il dottor Stefan Wernitznig, un post-doc del mio laboratorio. Questo protocollo consiste nella preparazione di campioni cerebrali per la microscopia elettronica, tagliando coppie di sezioni sottili.
Successivamente, descriverà come produrre automaticamente un numero definito di micrografie di elettroni in un'area di interesse. Quindi, utilizzerà un frame di conteggio per valutare la densità numerica delle caratteristiche strutturali. Per iniziare, sezionare, correggere, post-correggere e incorporare campioni di interesse nell'incorporamento della resina seguendo insieme al protocollo di testo di accompagnamento.
Quindi, posizionare il campione su un ultramicrotomo e produrre sezioni seriali ultra sottili da 55 nanometri. Posizionare le sezioni su una griglia di slot con le dimensioni di un millimetro per due millimetri, rivestite con forma di piola. Quindi, controsostenere le sezioni ultra sottili sulle griglie degli slot usando acetato di 2%uranil per 30 minuti, seguito da citrato di piombo per 30 secondi a temperatura ambiente.
Posizionare la griglia nel TEM ed esaminare le sezioni sulla griglia con il TEM utilizzando un ingrandimento basso per orientare e valutare la qualità delle sezioni. Avviare quindi il software TEM Serial Section, selezionare Sezione e scegliere Inserisci per aggiungere i punti d'angolo per la sezione di riferimento e ricerca. Seguire le istruzioni della finestra popup.
Iniziare con la sezione di riferimento e quindi continuare con la sezione di ricerca. Assicuratevi che gli spigoli della sezione siano paralleli alla sezione successiva, man mano che vengono immessi i punti uno e due. Visualizzare quindi la sezione di riferimento con un ingrandimento basso per identificare l'area di interesse.
Spostare lo stadio del microscopio utilizzando l'analisi delle immagini TEM nella sezione di riferimento in più punti d'angolo del ROI per creare un contorno del ROI. Registrare le coordinate del poligono risultante utilizzando il software di campionamento casuale dei punti. Per questo motivo, premere Aggiungi coordinate nella finestra di dialogo del software di campionamento a punti casuali in ogni punto del poligono necessario per delineare il ROI nella sezione.
Successivamente definire e inserire una dimensione adatta per le aree di campionamento e le distanze tra le aree nel software di campionamento casuale dei punti. Quindi, premete Calcola raster per generare coordinate in modo sistematico, uniforme e casuale per le posizioni della micrografia all'interno del poligono. Conservare i punti di campionamento nelle sezioni di riferimento e di ricerca, utilizzando il software Random Point Sampling e il software TEM Serial Section.
Queste sono le coordinate dei montaggi che vengono registrate in seguito. Nel software random point sampling, premere vai nella posizione successiva per spostare lo stadio del microscopio sulle coordinate x, y di ogni area di campionamento nella sezione di riferimento. Quindi, selezionate Posizione (Location) e scegliete Inserisci (Insert) per importare queste coordinate nel software TEM Serial Section nella sezione di riferimento.
Ripetere questa situazione per tutte le coordinate. Per specchiare le coordinate della sezione di riferimento nella sezione di ricerca, selezionate Sezione (Section) e scegliete Vai a sezione (Go to Section). Immettere il numero della sezione di ricerca nella finestra di dialogo.
Per la registrazione dei montaggi, passare dalla sezione di riferimento a una sezione di ricerca, come descritto in precedenza, e modificare la posizione nella sezione di riferimento con la posizione e passare al numero. Scegliete la coordinata successiva nella finestra di dialogo. Per i montaggi SerialEM, ad ogni coordinata di campionamento, andate su File e scegliete Nuovo montaggio dal menu a discesa.
Selezionare il numero di riquadri destro e la percentuale di sovrapposizione nella finestra di dialogo. Per il presente studio, un ingrandimento di 5000 è sufficiente per riconoscere le caratteristiche sinaptiche dello studio. Ma il campo visivo limitato della telecamera CCD richiedeva la realizzazione di montaggi di due per due immagini.
I montaggi sono fatti per SerialEM. Prima di registrare ogni montaggio, riregolare lo stato attivo o attivare l'opzione di messa a fuoco automatica nel software di registrazione. Scegliete la cartella per salvare il file di montaggio e iniziate la registrazione del montaggio premendo Start nel sottoprogramma di montaggio, a sinistra in SerialEM.
Avviare la microdissettrice e definire le dimensioni del frame di conteggio e il numero di segmenti in base alle esigenze. Contare la densità della sinapsi utilizzando la macro dissector. Utilizzando lo strumento multi-punto situato sulla barra degli strumenti, limitare le sinapsi che si intersecano con le due linee proibite del dissector, ma contano le sinapsi sulle linee di accettazione opposte.
Contrassegnare ogni sinapsi all'interno del frame di conteggio visibile nella sezione di riferimento, ma non visibile nella sezione di ricerca, con una selezione ovale. Per misurare i parametri della sinapsi, selezionare solo le sinapsi con una fessura sinaptica orientata nella sezione trasversale che si trova nella sezione di riferimento. Questo dovrebbe essere all'interno degli stessi fotogrammi immagine utilizzati per il dissector.
Quindi, vai a Plugins e quindi ad Analizza e avvia il plugin ObjectJ dal menu a discesa. Aprire un nuovo progetto dalla finestra di dialogo a discesa ObjectJ che aprirà una finestra che consente all'utente di delineare e contrassegnare le strutture con lo strumento marcatore. In primo luogo, utilizzare lo strumento marcatore per misurare la lunghezza della membrana pre-sinaptica e la lunghezza della densità post-sinaptica disegnando una linea lungo la struttura.
Quindi, ottenere la larghezza media della fessura sinaptica disegnando un poligono, coprendo sia la membrana pre che post-sinaptica. Per determinare il numero di vescicole ancorate, contare tutte le vescicole che hanno una distanza massima dalla membrana presinaptica di un diametro vescicolare o inferiore. Quindi, determinare il numero di vescicole non ancorate contando le vescicole con una distanza massima di un diametro vesicolare dalle vescicole ancorate o da altre vescicole non ancorate nella stessa sinapsi.
Una versione adattata del protocollo consente analisi elementali in luoghi ottenuti in modo imparziale all'interno della sezione ultra sottile. Per questo, in modalità di imaging TEM, avviare SerialEM e aprire un nuovo progetto. Quindi, apri il Navigatore e controlla le impostazioni della fotocamera nei controlli della fotocamera e dello script per visualizzare, registrare e avviare la visualizzazione.
Per creare una mappa d'angolo della sezione ultra sottile, scegliete Aggiungi punti nella finestra Navigatore. Quindi, impostare i punti d'angolo ai bordi di una sezione ultra sottile. Spostare il palco in un punto d'angolo tenendo premuto il tasto destro del mouse.
Quando viene raggiunto un angolo della sezione, aggiungere un punto d'angolo con un clic sinistro del mouse. Ripetere la procedura per aggiungere altri tre punti d'angolo. Assicurarsi che nella finestra Navigatore la casella C per i punti d'angolo sia spuntata per i punti memorizzati.
Per avviare il montaggio ad angolo, passare a Navigatore nella barra dei menu SerialEM e scegliere Montaging Grids e Setup Corner Montage dal menu a discesa. Selezionate Aggiungi poligono (Add Polygon) nella finestra Navigatore (Navigator) e delineate l'area di interesse con più clic con il pulsante destro del mouse. Quindi, scegliete Aggiungi griglia di punti nel menu a discesa Navigatore e definite una distanza tra i punti.
Avviare lo script EFTEMSerialEM, seguire i comandi di script, immettere il numero di punti griglia come mostrato nel Navigatore e immettere il numero di punti di acquisizione. Quindi, impostare la soglia di illuminazione in modo che lo script possa evitare le barre della griglia. Seguire i comandi dello script e spostare manualmente la fase per coprire il campo visivo di un quarto della barra della griglia.
In base al valore visualizzato, immettere un valore di illuminazione di soglia superiore al valore visualizzato. Attendere che i punti per l'acquisizione siano selezionati e la routine di cottura sia terminata. Questo richiede molto tempo e può essere fatto durante la notte.
Dopo la configurazione per l'analisi elementale TEM filtrata dall'energia, acquisire una mappa elementale con impostazioni specifiche dell'elemento. L'approccio di campionamento imparziale è utile per contare e analizzare le caratteristiche sinaptiche in specifiche regioni cerebrali. Inoltre, lo script EFTEMSerialEM per il software SerialEM consente di scegliere casualmente i punti di acquisizione all'interno di un'intera sezione ultra sottile, con l'obiettivo di ottenere una micrografia elettronica filtrata dall'energia in ciascuno di questi punti.
Lo script ha selezionato casualmente un numero di punti, predefiniti dall'utente tra quelli contrassegnati con una scarpata. Producendo una micrografia di prova e controllandone i livelli di grado, lo script ha verificato se i punti scelti si trovavano su una parte visibile della sezione, rifiutando i punti che atterravano sulle barre della griglia. La maggior parte del flusso di lavoro è stata gestita dallo script, con un'interazione minima dell'utente.
Tuttavia, con il campione mostrato qui, c'era troppa poca luce per la routine di messa a fuoco automatica di SerialEM. Pertanto, non appena lo script ha spostato lo stage in ogni punto, lo stato attivo è stato regolato e una mappa elementale è stata fatta di ferro. È importante selezionare attentamente la regione di interesse e garantire che lo stesso numero di punti di campionamento rientri in ogni area di interesse.
Non dimenticare che molte delle sostanze chimiche utilizzate per la preparazione del campione sono tossiche. Quindi indossa un camice da laboratorio e guanti protettivi e lavora sotto una copertura di fumi.
