Um protocolo de amostragem imparcial é vital para microscopia eletrônica. Se você quiser quantificá-lo em densidade numérica de sinapses ou outras estruturas em uma determinada área cerebral, a principal vantagem de nossa técnica é que ela é imparcial, e permite produzir automaticamente micrografos eletrônicos com mínima intervenção do usuário. Essa técnica também é valiosa em outras áreas de pesquisa, como a neurociência, onde pode ser usada na avaliação da força de uma rede neural.
Para aplicar nosso protocolo, é necessário ter experiência em técnicas microscópicas eletrônicas, como preparação de amostras e operação de um microscópio eletrônico de transição. Demonstrando nosso procedimento será o Dr. Stefan Wernitznig, um pós-doutor do meu laboratório. Este protocolo consiste em preparar amostras cerebrais para microscopia eletrônica, cortando pares de seções finas.
Em seguida, ele descreverá como produzir automaticamente um número definido de micrografos eletrônicos em uma área de interesse. Em seguida, usará um quadro de contagem para avaliar a densidade numérica das características estruturais. Para começar, dissecar, corrigir, corrigir e incorporar amostras de interesse para incorporar resina, seguindo junto com o protocolo de texto que acompanha.
Em seguida, coloque a amostra em um ultramicroome e produza seções de série ultra finas de 55 nanômetros. Coloque as seções em uma grade de ranhura com as dimensões de um milímetro por dois milímetros, revestidas com forma de piola. Em seguida, contra-retiver as seções ultra finas nas grades de ranhura usando acetato de 2%deuranyl por 30 minutos, seguido por citrato de chumbo por 30 segundos em temperatura ambiente.
Coloque a grade no TEM e examine as seções na grade com o TEM usando uma baixa ampliação para orientar e avaliar a qualidade das seções. Em seguida, inicie o software tem serial section, selecione Seção e escolha Inserir para adicionar os pontos de canto para a seção de referência e pesquisa. Siga as instruções da janela pop-up.
Comece com a seção de referência e continue com a seção de procuração. Certifique-se de que as bordas da seção são paralelas à próxima seção, pois os pontos um e dois são inseridos. Em seguida, visualize a seção de referência sob baixa ampliação para identificar a região de interesse.
Mova o estágio do microscópio usando a análise de imagem TEM na seção de referência para vários pontos de canto do ROI para criar um contorno do ROI. Registo as coordenadas do polígono resultante usando o software Random Point Sampling. Para isso, pressione Adicionar coordenadas na caixa de diálogo do software random point sampling em cada ponto do polígono necessário para delinear o ROI na seção.
Em seguida, defina e insira um tamanho adequado para as áreas de amostragem e distâncias entre as áreas no software random point sampling. Em seguida, pressione Calcular Raster para gerar coordenadas de forma sistemática, uniforme e aleatória para as posições do micrografo dentro do polígono. Armazene os pontos de amostragem nas seções de referência e pesquisa, usando o software Random Point Sampling e o software TEM Serial Section.
Estas são as coordenadas das montagens que são gravadas depois. No software Random Point Sampling, pressione ir para a próxima posição para mover o estágio do microscópio para as coordenadas x e y de cada área de amostragem na seção de referência. Em seguida, selecione Localização e escolha Inserir para importar essas coordenadas no software seção serial TEM na seção de referência.
Repita isso para todas as coordenadas. Para espelhar as coordenadas da seção de referência na seção de pesquisa, selecione Seção e escolha Ir para Seção. Digite o número da seção de procuração na janela de diálogo.
Para a gravação das montagens, altere entre a seção de referência e procuração, conforme descrito anteriormente, e altere a posição na seção de referência com localização e vá para o número. Escolha a próxima coordenada na janela de diálogo. Para as montagens serialem, em cada coordenada de amostragem, vá para Arquivo e escolha Nova Montagem no menu suspenso.
Selecione o número certo de telhas e a porcentagem de sobreposição na janela de diálogo. Para o presente estudo, basta reconhecer as características sinápticas do estudo. Mas o campo de visão limitado da câmera CCD exigia fazer montagens de duas por duas imagens.
As montagens são feitas para SerialEM. Antes de gravar cada montagem, reajuste o foco ou ative a opção de foco automático no software de gravação. Escolha a pasta para salvar o arquivo de montagem e inicie a gravação da montagem pressionando Iniciar no subempresa de montagem, à esquerda no SerialEM.
Inicie o microdissetor e defina o tamanho do quadro de contagem e o número de segmentos conforme necessário. Conte a densidade da sinapse usando a macro dissecador. Utilizando a ferramenta de vários pontos localizada na barra de ferramentas, limite as sinapses que se cruzam com as duas linhas proibidas do dissetor, mas contam sinapses nas linhas de aceitação opostas.
Marque cada sinapse dentro do quadro de contagem que é visível na seção de referência, mas não visível na seção de procuração, com uma seleção oval. Para medir os parâmetros da sinapse, selecione apenas as sinapses com uma fissura sinapática orientada em seção transversal que está na seção de referência. Isso deve estar dentro dos mesmos quadros de imagem usados para o dissetor.
Em seguida, vá para Plugins e, em seguida, para Analisar e iniciar o ObjectJ plugin a partir do menu suspenso. Abra um novo projeto a partir da caixa de diálogo drop-down do ObjectJ que abrirá uma janela que permite ao usuário delinear e marcar estruturas com a ferramenta marcador. Primeiro, use a ferramenta marcadora para medir o comprimento da membrana pré-sináptica e o comprimento da densidade pós-sináptica, desenhando uma linha ao longo da estrutura.
Em seguida, obtenha a largura média da fissura sináptica desenhando um polígono, cobrindo tanto a membrana pré quanto pós-sináptica. Para determinar o número de vesículas ancoradas, conte todas as vesículas que têm uma distância máxima da membrana pré-sináptica de um diâmetro vesícula ou menos. Em seguida, determine o número de vesículas desencaixadas contando as vesículas com uma distância máxima de um diâmetro vesícula acoplado ou outras vesículas desencaixadas na mesma sinapse.
Uma versão adaptada do protocolo permite análises elementares em locais obtidos imparcialmente dentro da seção ultra fina. Para isso, no modo de imagem TEM, inicie o SerialEM e abra um novo projeto. Em seguida, abra o Navegador e verifique as configurações da câmera nos controles de câmera e script para ver e gravar e iniciar a visualização.
Para fazer um mapa de canto da seção ultra fina, escolha Adicionar pontos na janela Navegador. Em seguida, coloque os pontos de canto nas bordas de uma seção ultra fina. Mova o palco para um ponto de canto segurando a chave do mouse direito.
Quando um canto da seção for atingido, adicione um ponto de canto com um clique do mouse esquerdo. Repita o procedimento para adicionar mais três pontos de canto. Certifique-se de que na janela Navegador, a caixa C para pontos de canto esteja marcada para os pontos armazenados.
Para iniciar a montagem do canto, vá até o Navigator na barra de menu SerialEM e escolha Montaging Grids e Setup Corner Montage no menu suspenso. Escolha Adicionar Polígono na janela Navegador e delineie a região de interesse com vários cliques do mouse direito. Em seguida, escolha Adicionar grade de pontos no menu suspenso do Navegador e defina uma distância entre os pontos.
Inicie o script EFTEMSerialEM, siga os comandos de script, digite o número de pontos de grade como mostrado no Navegador e digite o número de pontos de aquisição. Em seguida, defina o limiar de iluminação para que o script possa evitar barras de grade. Siga os comandos de script e mova o palco manualmente para cobrir o campo de visão por um quarto da barra de grade.
De acordo com o valor exibido, digite um valor de iluminação limiar superior ao valor exibido. Aguarde até que os pontos para aquisição sejam selecionados e a rotina de cozimento esteja concluída. Isso leva muito tempo e pode ser feito da noite para o dia.
Após a configuração para análise elementar TEM filtrada por energia, adquira um mapa elementar com configurações específicas de elementos. A abordagem amostral imparcial é útil para contar e analisar características sinápticas em regiões cerebrais específicas. Além disso, o script EFTEMSerialEM para o software SerialEM permite escolher aleatoriamente os pontos de aquisição de dentro de uma seção ultra fina, com o objetivo de obter um micrografo eletrônico filtrado por energia em cada um desses pontos.
O script selecionou aleatoriamente uma série de pontos, pré-definidos pelo usuário daqueles marcados com uma classificação. Ao produzir um micrografo de teste e verificar seus níveis de nota, o script verificou se os pontos escolhidos estavam localizados em uma parte visível da seção, rejeitando os pontos que pousaram nas barras de grade. A maior parte do fluxo de trabalho foi manuseada pelo script, com pouca interação do usuário.
No entanto, com a amostra mostrada aqui, havia pouca luz para a rotina de foco automático do SerialEM. Portanto, assim que o roteiro mudou o palco para cada ponto, o foco foi ajustado e um mapa elementar foi feito de ferro. É importante selecionar cuidadosamente a região de interesse e garantir que o mesmo número de pontos amostrais caia em cada área de interesse.
Não se esqueça que muitos dos produtos químicos usados para a preparação dos espécimes são tóxicos. Então use um jaleco e luvas de proteção e trabalhe sob uma capa de fumaça.
