Непредвзятый протокол отбора проб имеет жизненно важное значение для электронной микроскопии. Если вы хотите количественно оценить его по численной плотности синапсов или других структур в определенной области мозга, главное преимущество нашей техники заключается в том, что она непредвзята и позволяет автоматически производить электронные микрографы с минимальным вмешательством пользователя. Этот метод также ценен в других областях исследований, таких как неврология, где он может быть использован в оценке прочности нейронной сети.
Для того, чтобы применить наш протокол, необходимо иметь опыт работы с электронными микроскопическими методами, такими как подготовка образца и эксплуатация переходного электронного микроскопа. Демонстрацией нашей процедуры будет доктор Стефан Верницниг, пост-док из моей лаборатории. Этот протокол состоит из подготовки образцов мозга для электронной микроскопии, разрезания пар тонких секций.
Далее, он будет описывать, как автоматически производить определенное количество электронных микрографов в области, представляющие интерес. Затем он будет использовать рамку подсчета для оценки численной плотности структурных объектов. Для начала, вскрыть, исправить, пост-исправить, и вставлять образцы, представляющие интерес в встраивании смолы, следуя вместе с сопроводительным текстовым протоколом.
Затем поместите образец на ультрамикротом и произвести 55 нанометров сверхтонких серийных секций. Поместите секции на слот-сетку размером один миллиметр на два миллиметра, покрытую пиолой. Затем счетчики ультра тонкие секции на слот сетки с использованием 2%уранил ацетат в течение 30 минут, а затем свинца цитрата в течение 30 секунд при комнатной температуре.
Поместите сетку в TEM и изучить разделы на сетке с TEM с помощью низкого увеличения для ориентации и оценки качества разделов. Затем запустите программное обеспечение TEM Serial Section, выберите раздел и выберите Insert, чтобы добавить угловые точки для раздела справки и осмотра. Следуйте инструкциям всплывающего окна.
Начните с справочного раздела, а затем продолжить с разделом осмотра. Убедитесь, что края раздела параллельны следующему разделу, так как точки один и два введены. Далее визуализировать справочный раздел под низким увеличением, чтобы определить область интереса.
Переместите стадию микроскопа с помощью анализа изображений TEM в справочном разделе в несколько угловых точек рентабельности инвестиций, чтобы создать контур рентабельности инвестиций. Запись координат полученного полигона с помощью программного обеспечения Random Point Sampling. Для этого нажмите Добавить координаты в диалоговом поле программного обеспечения Random Point Sampling в каждой точке полигона, который необходим для набросков рентабельности инвестиций в разделе.
Затем определите и введите подходящий размер для областей выборки и расстояний между областями в программное обеспечение выборка случайных тока. Затем нажмите Вычислить Raster для создания координат в систематической, равномерной, случайной моды для микрографа позиции в полигоне. Храните точки выборки в разделах ссылки и осмотра с помощью программного обеспечения Random Point Sampling и программного обеспечения TEM Serial Section.
Это координаты монтажей, которые записываются впоследствии. В программном обеспечении Random Point Sampling нажмите на следующее положение, чтобы переместить стадию микроскопа в x, y-координаты каждой области выборки в справочном разделе. Затем выберите Местоположение и выберите Insert для импорта этих координат в программном обеспечении TEM Serial Section в справочном разделе.
Повторите это для всех координат. Чтобы отразить координаты из справочного раздела в разделе осмотра, выберите раздел и выберите Перейти к разделу. Введите номер раздела осмотра в окне диалога.
Для записи монтажей переключитесь между ссылкой и разделом осмотра, как описано ранее, и измените положение в справочном разделе с местоположением и перейдите на номер. Выберите следующую координату в диалоговом окне. Для serialEM монтажи, при каждой координации выборки, перейдите в файл и выбрать новый монтаж из выпадают меню.
Выберите нужное количество плиток и процент перекрытия в окне диалога. Для настоящего исследования, увеличение 5000 достаточно, чтобы признать синаптические особенности на исследование. Но ограниченное поле зрения камеры CCD требуется сделать монтажи из двух на два изображения.
Монтажи сделаны для SerialEM. Перед записью каждого монтажа скорректируйте фокус или активируйте опцию автоматического фокусировки в программном обеспечении для записи. Выберите папку, чтобы сохранить файл монтажа и начать запись монтажа, нажав Начало в монтаже подменю, слева в SerialEM.
Запустите микродиссер и определите размер кадра подсчета и количество сегментов по мере необходимости. Подсчитайте плотность синапса с помощью макроса пресектора. Используя многоочные инструменты, расположенные в панели инструментов, ограничьте те синапсы, которые пересекаются с двумя запрещенными линиями рассечения, но подсчитывают синапсы на противоположных линиях принятия.
Отметте каждый синапс в рамке подсчета, которая видна в справочном разделе, но не видна в разделе осмотра, с овальным выделением. Для измерения параметров синапса выберите только синапсы с синаптической расщелиной, ориентированной на поперечное сечение, которое находится на справочном разделе. Это должно быть в пределах тех же кадров изображения, используемых для вскрытия.
Далее перейдите в Plugins, а затем проанализировать и начать плагин ObjectJ из выпадают меню. Откройте новый проект из диалога ObjectJ, который откроет окно, которое позволит пользователю наметить и отметить структуры с помощью инструмента маркера. Во-первых, используйте маркер инструмент для измерения длины до синаптической мембраны и пост-синаптической плотности длины, рисуя линию вдоль структуры.
Затем получить средняя ширина синаптической расщелины, нарисовав полигон, охватывающий как до-, так и пост-синаптической мембраны. Чтобы определить количество состыковах пузырьков, подсчитайте все пузырьки, которые имеют максимальное расстояние от до синаптической мембраны диаметром одной везикулы или меньше. Затем определите количество отстыковах пузырьков, подсчитав пузырьки с максимальным расстоянием диаметром одной везикулы от пристыкована или других отстыкована пузырьков при том же синапсе.
Адаптированная версия протокола позволяет анализировать элементы в объективно полученных местах в сверхтонкой секции. Для этого в режиме визуализации TEM запустите SerialEM и откройте новый проект. Затем откройте Навигатор и проверьте настройки камеры в элементе управления камерой и скриптом для просмотра и записи и просмотра.
Чтобы составить угловую карту ультратонкой секции, выберите Дополнительные точки в окне Navigator. Затем установите угловые точки по краям ультратонкой секции. Переместив сцену в угловую точку, удерживая правый ключ мыши.
Когда угол раздела достигнут, добавьте угловую точку с щелчком левой мыши. Повторите процедуру, чтобы добавить еще три угловых точки. Убедитесь, что в окне Navigator поле C для угловых точек галочкой для сохраненных точек.
Чтобы начать угловой монтаж, перейдите в Navigator в баре меню SerialEM и выберите Montaging Grids и Setup Corner Montage из выпадают из меню. Выберите Добавить полигон в окне Navigator и наметить область интереса с несколькими щелчками правой мыши. Далее выберите Add Grid of Points в меню высадки Навигатора и определите расстояние между точками.
Запустите сценарий EFTEMSerialEM, следуйте командам скрипта, введите количество точек сетки, как показано в Навигаторе, и введите количество точек приобретения. Затем установите порог освещения, чтобы сценарий можно было избежать сетки баров. Следуйте командам скрипта и переместите сцену вручную, чтобы покрыть поле зрения на четверть сетки.
В соответствии с отображаемое значение введите пороговое значение освещения, которое выше отображаемого значения. Подождите, пока очки для приобретения будут выбраны и рутина приготовления пищи будет закончена. Это занимает много времени и может быть сделано в одночасье.
После настройки для энергофильтрованного элементарного анализа TEM приобрети элементарную карту с настройками, специфичными для элементов. Непредвзятый подход к выборке полезен для подсчета и анализа синаптических особенностей в определенных областях мозга. Кроме того, скрипт EFTEMSerialEM для программного обеспечения SerialEM позволяет случайным образом выбирать точки приобретения изнутри целого сверхтонкого раздела с целью получения электронного микрографа с энергетической фильтрацией в каждой из этих точек.
Скрипт случайным образом выбрал ряд точек, предварительно определенных пользователем, из тех, которые отмечены классификацией. Производя тестовый микрограф и проверяя его уровни классов, скрипт проверяет, находятся ли выбранные точки на видимой части раздела, отвергая точки, которые приземляются на решетки. Большая часть рабочего процесса была обработана скриптом, с минимальным взаимодействием пользователя.
Тем не менее, с образцом показано здесь, было слишком мало света для автоматической рутины фокус SerialEM. Поэтому, как только сценарий переместил сцену в каждую точку, фокус был скорректирован и элементарная карта была сделана из железа. Важно тщательно выбрать область, представляющий интерес, и обеспечить, чтобы одинаковое число точек отбора проб попадает в каждую область, представляющие интерес.
Не забывайте, что многие химические вещества, используемые для подготовки образцов являются токсичными. Так что носите лабораторное пальто и защитные перчатки и работа под дымовой крышкой.
