Ein unvoreingenommenes Probenahmeprotokoll ist für die Elektronenmikroskopie von entscheidender Bedeutung. Wenn Sie es auf numerische Dichte von Synapsen oder anderen Strukturen in einem bestimmten Gehirnbereich quantifizieren möchten, ist der Hauptvorteil unserer Technik, dass sie unvoreingenommen ist und es ermöglicht, automatisch Elektronenmikroskopie mit minimalem Benutzereingriff zu erzeugen. Diese Technik ist auch in anderen Forschungsbereichen, wie der Neurowissenschaften, wertvoll, wo sie bei der Beurteilung der Stärke eines neuronalen Netzwerks eingesetzt werden kann.
Um unser Protokoll anzuwenden, ist es notwendig, Erfahrung in elektronenmikroskopischen Techniken zu haben, wie z. B. Probenvorbereitung und Betrieb eines Übergangselektronenmikroskops. Demonstriert unser Verfahren zeigt Dr.Stefan Wernitznig, ein Post-Doc aus meinem Labor. Dieses Protokoll besteht aus der Vorbereitung von Gehirnproben für die Elektronenmikroskopie, schneiden Paare von dünnen Abschnitten.
Als Nächstes wird beschrieben, wie automatisch eine definierte Anzahl von Elektronenmikroskopen in einem Interessengebiet erzeugt wird. Anschließend wird ein Zählrahmen verwendet, um die numerische Dichte von Strukturmerkmalen zu bewerten. Um zu beginnen, sezieren, fixieren, korrigieren und betten Sie Proben von Interesse in das Einbetten von Harz ein, indem Sie zusammen mit dem begleitenden Textprotokoll folgen.
Legen Sie die Probe dann auf ein Ultramikrotom und produzieren Sie 55 Nanometer ultradünne serielle Abschnitte. Platzieren Sie die Abschnitte auf einem Schlitzgitter mit den Abmessungen von einem Millimeter mal zwei Millimetern, beschichtet mit Piola-Form. Dann die ultradünnen Abschnitte auf den Schlitzgittern mit 2%uranylacetat für 30 Minuten gegenstainieren, gefolgt von Bleicitrat für 30 Sekunden bei Raumtemperatur.
Legen Sie das Raster in das TEM und untersuchen Sie die Abschnitte auf dem Raster mit dem TEM mit einer geringen Vergrößerung, um die Qualität der Abschnitte zu orientieren und zu bewerten. Starten Sie dann die TEM Serial Section-Software, wählen Sie Abschnitt aus, und wählen Sie Einfügen aus, um die Eckpunkte für den Referenz- und Nachschlageabschnitt hinzuzufügen. Folgen Sie den Anweisungen des Popup-Fensters.
Beginnen Sie mit dem Referenzabschnitt, und fahren Sie dann mit dem Nachschlageabschnitt fort. Stellen Sie sicher, dass die Kanten des Abschnitts parallel zum nächsten Abschnitt sind, da die Punkte eins und zwei eingegeben werden. Als Nächstes visualisieren Sie den Referenzabschnitt unter geringer Vergrößerung, um den Interessenbereich zu identifizieren.
Verschieben Sie die Mikroskopstufe mithilfe der TEM-Bildanalyse im Referenzabschnitt auf mehrere Eckpunkte des ROI, um einen Umriss des ROI zu erstellen. Zeichnen Sie die Koordinaten des resultierenden Polygons mit der Random Point Sampling-Software auf. Drücken Sie dazu im Dialogfeld der Random Point Sampling-Software an jedem Punkt des Polygons, der zum Umreißen des ROI im Abschnitt erforderlich ist, Koordinaten hinzufügen.
Als Nächstes definieren und geben Sie eine geeignete Größe für die Stichprobenbereiche und Abstände zwischen den Bereichen in die Random Point Sampling-Software ein. Drücken Sie dann Raster berechnen, um Koordinaten systematisch, einheitlich und zufällig für die Positionen des Mikrographen innerhalb des Polygons zu generieren. Speichern Sie die Samplingpunkte in den Referenz- und Suchabschnitten mithilfe der Random Point Sampling-Software und der TEM Serial Section-Software.
Dies sind die Koordinaten der Montagen, die danach aufgezeichnet werden. Drücken Sie in der Random Point Sampling-Software zur nächsten Position, um die Mikroskopstufe auf die x-, y-Koordinaten jedes Samplingbereichs im Referenzabschnitt zu verschieben. Wählen Sie dann Location aus, und wählen Sie Einfügen aus, um diese Koordinaten in der TEM Serial Section-Software im Referenzabschnitt zu importieren.
Wiederholen Sie dies für alle Koordinaten. Um die Koordinaten aus dem Referenzabschnitt in den Suchabschnitt zu spiegeln, wählen Sie Abschnitt aus, und wählen Sie Zum Abschnitt gehen aus. Geben Sie die Nummer des Nachsuchabschnitts im Dialogfeld ein.
Wechseln Sie für die Aufzeichnung der Montagen zwischen dem Referenz- und dem Nachschlageabschnitt, wie zuvor beschrieben, und ändern Sie die Position im Referenzabschnitt mit der Position, und gehen Sie zur Nummer. Wählen Sie die nächste Koordinate im Dialogfenster aus. Wechseln Sie für die SerialEM-Montagen zu jeder Sampling-Koordinate zu Datei und wählen Sie im Dropdown-Menü Neue Montage aus.
Wählen Sie im Dialogfenster die richtige Anzahl von Kacheln und den Prozentsatz der Überlappung aus. Für die vorliegende Studie reicht eine Vergrößerung von 5000 aus, um die synaptischen Merkmale der Studie zu erkennen. Aber das begrenzte Sichtfeld der CCD-Kamera erforderte die Herstellung von Montagen von zwei mal zwei Bildern.
Die Montagen werden an SerialEM hergestellt. Bevor Sie jede Montage aufzeichnen, richten Sie den Fokus neu oder aktivieren Sie die Autofokus-Option in der Aufnahmesoftware. Wählen Sie den Ordner aus, um die Montagedatei zu speichern, und starten Sie die Aufzeichnung der Montage, indem Sie im Untermenü "Montage" links in SerialEM auf Start drücken.
Starten Sie den Mikrodissektor, und definieren Sie die Größe des Zählrahmens und die Anzahl der Segmente nach Bedarf. Zählen Sie die Synapsendichte mithilfe des Dissektormakros. Beschränken Sie mit dem Multi-Point-Tool in der Symbolleiste die Synapsen, die sich mit den beiden verbotenen Linien des Dissektors schneiden, aber zählen Synapsen auf den entgegengesetzten Annahmelinien.
Markieren Sie jede Synapse innerhalb des Zählrahmens, die im Referenzabschnitt sichtbar, im Suchabschnitt jedoch nicht sichtbar ist, mit einer ovalen Auswahl. Um Synapseparameter zu messen, wählen Sie nur die Synapsen mit einem synaptischen Spalten aus, der im Querschnitt orientiert ist, der sich auf dem Referenzabschnitt befindet. Dies sollte sich innerhalb der gleichen Bildrahmen befinden, die für den Dissektor verwendet werden.
Gehen Sie als Nächstes zu Plugins und dann zu Analysieren und starten Sie das Plugin ObjectJ aus dem Dropdown-Menü. Öffnen Sie ein neues Projekt aus dem Dropdown-Dialogfeld ObjectJ, das ein Fenster öffnet, in dem der Benutzer Strukturen mit dem Markerwerkzeug umreißen und markieren kann. Verwenden Sie zunächst das Markerwerkzeug, um die Länge der präsynaptischen Membran und die postsynaptische Dichtelänge zu messen, indem Sie eine Linie entlang der Struktur zeichnen.
Erhalten Sie dann die mittlere Breite des synaptischen Spalten, indem Sie ein Polygon zeichnen, das sowohl die prä- als auch die postsynaptische Membran abdeckt. Um die Anzahl der angedockten Vesikel zu bestimmen, zählen Sie alle Vesikel, die einen maximalen Abstand von der präsynaptischen Membran eines Vesikeldurchmessers oder weniger haben. Bestimmen Sie dann die Anzahl der abgedockten Vesikel, indem Sie die Vesikel mit einem maximalen Abstand von einem Vesikeldurchmesser von angedockten oder anderen ungedockten Vesikeln an derselben Synapse zählen.
Eine angepasste Version des Protokolls ermöglicht elementare Analysen an unvoreingenommen erhaltenen Stellen innerhalb des ultradünnen Abschnitts. Starten Sie dazu im TEM-Bildgebungsmodus SerialEM und eröffnen Sie ein neues Projekt. Öffnen Sie dann den Navigator, und überprüfen Sie die Einstellungen für die Kamera in Kamera- und Skriptsteuerelementen für die Ansicht und Aufzeichnung und Startansicht.
Um eine Eckkarte des ultradünnen Abschnitts zu erstellen, wählen Sie Punkte hinzufügen im Navigator-Fenster aus. Legen Sie dann die Eckpunkte an den Rändern eines ultradünnen Abschnitts fest. Bewegen Sie die Bühne zu einem Eckpunkt, indem Sie die rechte Maustaste gedrückt halten.
Wenn eine Ecke des Abschnitts erreicht ist, fügen Sie einen Eckpunkt mit einem linken Mausklick hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang, um drei weitere Eckpunkte hinzuzufügen. Stellen Sie sicher, dass im Navigator-Fenster das Feld C für Eckpunkte für die gespeicherten Punkte angekreuzt ist.
Um die Eckmontage zu starten, gehen Sie in der SerialEM-Menüleiste zu Navigator und wählen Sie im Dropdown-Menü Montaging Grids und Setup Corner Montage aus. Wählen Sie Polygon hinzufügen im Navigator-Fenster und skizzieren Sie den Interessenbereich mit mehreren Rechten Mausklicks. Wählen Sie als Nächstes im Dropdown-Menü Navigator die Option Punkteraster hinzufügen aus, und definieren Sie einen Abstand zwischen den Punkten.
Starten Sie das EFTEMSerialEM-Skript, folgen Sie den Skriptbefehlen, geben Sie die Anzahl der Rasterpunkte ein, wie im Navigator gezeigt, und geben Sie die Anzahl der Erfassungspunkte ein. Legen Sie dann den Beleuchtungsschwellenwert fest, damit das Skript Rasterleisten vermeiden kann. Folgen Sie den Skriptbefehlen, und verschieben Sie die Bühne manuell, um das Sichtfeld um ein Viertel der Rasterleiste abzudecken.
Geben Sie gemäß dem angezeigten Wert einen Schwellenwert für die Beleuchtung ein, der höher als der angezeigte Wert ist. Warten Sie, bis die Punkte für die Erfassung ausgewählt sind und die Kochroutine abgeschlossen ist. Dies dauert lange und kann über Nacht durchgeführt werden.
Nachdem Sie eine elementare Karte mit elementspezifischen Einstellungen eingerichtet haben, erwerben Sie eine elementare Karte. Der unvoreingenommene Sampling-Ansatz ist nützlich für das Zählen und Analysieren synaptischer Merkmale in bestimmten Hirnregionen. Darüber hinaus ermöglicht das EFTEMSerialEM-Skript für die SerialEM-Software die zufällige Auswahl der Erfassungspunkte innerhalb eines ganzen ultradünnen Abschnitts mit dem Ziel, an jedem dieser Punkte einen energiegefilterten Elektronenmikroskop zu erhalten.
Das Skript wählte nach dem Zufallsprinzip eine Anzahl von Punkten aus, die vom Benutzer aus den mit einer Benotung markierten Punkten vordefiniert wurden. Durch die Erstellung eines Testmikroskops und die Überprüfung seiner Notenebenen überprüfte das Skript, ob sich die ausgewählten Punkte auf einem sichtbaren Teil des Abschnitts befanden, und lehnte die Punkte ab, die auf Gitterstäben landeten. Der großteil der Workflows wurde vom Skript mit minimaler Interaktion des Benutzers verarbeitet.
Mit dem hier gezeigten Beispiel gab es jedoch zu wenig Licht für die Autofokus-Routine von SerialEM. Sobald das Skript die Bühne auf jeden Punkt verschoben hat, wurde der Fokus angepasst und eine Elementarkarte aus Eisen erstellt. Es ist wichtig, die Interessenregion sorgfältig auszuwählen und sicherzustellen, dass die gleiche Anzahl von Probenahmestellen in jeden Interessenbereich fällt.
Vergessen Sie nicht, dass viele der Chemikalien, die für die Probenvorbereitung verwendet werden, giftig sind. Tragen Sie also einen Labormantel und Schutzhandschuhe und arbeiten Sie unter einer Rauchschutzhülle.
